線粒體Rho蛋白1對無鎂致癇大鼠海馬神經元的作用及其機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　癲癇(epilepsy, EP)是由多種原因引起的，以反復出現神經元異常放電所致的短暫性腦功能障礙為特征的一組病變。長期、反復發(fā)作的癲癇嚴重影響著患者的生活和工作，也給家庭，社會帶來了較大的負面影響。癲癇發(fā)病機制的復雜性，使得至今尚未能了解其全部機制，因而進一步明確癲癇的發(fā)病機理及尋求新的診治靶點具有重要意義。
　　線粒體具有為細胞生理活動提供能量和調控信號傳導等重要作用。因此近年來成為癲癇發(fā)病機制的研究熱

2、點。以往研究經證實癲癇發(fā)作可使線粒體功能受損，造成大量的變性蛋白質和受損細胞器堆積在細胞內。同時使損傷的線粒體膜電位降低，并發(fā)生通透性轉運，釋放凋亡相關因子，最終引起細胞凋亡，形成神經元對癲癇損傷更加敏感的惡性循環(huán)。因此，及時清除受損線粒體和維持線粒體正常功能顯得至關重要。
　　線粒體移動在清除受損線粒體和維持線粒體正常功能中發(fā)揮重要作用:線粒體移動可將受損線粒體逆行運動至胞體被降解和回收，同時將正常線粒體順向運動至神經元的作用部

3、位而發(fā)揮功能，以保證病理狀態(tài)下線粒體在細胞中占領正確的位置及分布，來應對病理損傷。然而，關于線粒體是如何移動的機制并不明確，一些相關研究證實存在一部分與線粒體移動密切相關聯(lián)蛋白質分子，如為線粒體移動提供驅動力的馬達分子Kinesin（驅動蛋白）、Dynein（動力蛋白）和Myosin（肌球蛋白）；將馬達分子與線粒體相連的銜接蛋白如Miro1/2（mitochondrial Rho-GTPase1/2）、Milton和Syntabulin

4、。Miro蛋白是小GTPase家族中的一員，它的N端和C端各有一個GTPase結構域，同時含有與Ca2+相結合的EF手型結構域，其通過C端跨膜區(qū)域與線粒體定向結合。以往研究發(fā)現，Miro可與Milton形成復合物，然后與Kinesin肌球重鏈（KHC）連接，進而調控線粒體沿微管的快速移動。
　　目前，大量國內外研究證實癲癇過程中存在線粒體功能及結構損傷。但線粒體移動異常在癲癇神經元線粒體功能結構受損中發(fā)揮何種作用；能否通過調控線粒

5、體移動而發(fā)揮神經保護作用仍然未知。因此，本課題在前期實驗的基礎上,通過體外原代培養(yǎng)海馬神經元及無鎂誘導建立癲癇放電模型，同時構建腺病毒真核表達質粒干預Miro1表達，通過觀察Miro1介導的線粒體移動對無鎂致癇的海馬神經元細胞形態(tài)、細胞活性、神經元損傷和凋亡的影響，探討是否通過調控線粒體移動，減少線粒體損傷，抗凋亡級聯(lián)發(fā)揮癲癇神經保護作用，并通過檢測神經元中Bax、caspase-3及Bcl-2表達水平的變化，初步探討其中的可能機制。<

6、br>　　材料與方法：
　　取新生24h內Sprague-Dawley大鼠，75％酒精浸泡消毒后，斷頭取腦，分離雙側海馬組織，制成單細胞懸液，體外進行大鼠海馬神經元的原代培養(yǎng)。于倒置相差顯微鏡下觀察海馬神經元在培養(yǎng)過程中的形態(tài)學變化，選取培養(yǎng)至10d的神經元細胞，采用免疫熒光的方法進行神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）神經元純度鑒定。同時構建表達大鼠Miro1基因的重組腺病毒真核表達質粒

7、（rAd-Miro1）以及不表達任何外源基因的對照腺病毒載體(rAd)，并鑒定。取培養(yǎng)至14d的海馬神經元隨機分為對照組（CON組）、無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組四組，后三組按照Sombati細胞模型方法，進行無鎂細胞外液處理3h后恢復至正常細胞培養(yǎng)液，其中無鎂誘導+rAd轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組在無鎂細胞外液誘導前48h分別轉染rAd及 rAd-Miro1進行預處理。造模成功

8、24h后通過MTS試劑盒分別測定各組海馬神經元細胞活性變化，取各組中部分細胞采用TUNEL法檢測神經元凋亡情況，剩余細胞采用QT-PCR法測定Miro1 mRNA的表達，Western blot法檢測Miro1、Bax、Bcl-2及Caspase3的表達。
　　結果：
　　1．細胞形態(tài)學觀察：倒置差相顯微鏡下可觀察到剛種植于細胞培養(yǎng)板內的大鼠海馬神經元為較小體積的單個細胞，呈圓形，飽滿，透亮，且散在分布。部分神經元細胞在培養(yǎng)

9、3h后開始貼壁，幾乎所有的神經元細胞培養(yǎng)至24h后均貼壁生長，并且有明顯的長短不一的突起長出。培養(yǎng)至7d時，典型的神經元軸突與樹突即可被觀察到，且胞體立體感強，細胞核呈空泡狀，但神經元與神經元之間尚未形成突觸，大多為單個細胞。培養(yǎng)至10d左右大鼠海馬神經元之間開始形成網狀聯(lián)系。培養(yǎng)至14d時神經元胞體最大，軸突、樹突清晰，細胞間網絡變得密集。培養(yǎng)至至4w時，維持液中開始有大量細胞碎片出現，細胞逐漸凋亡。
　　2．海馬神經元純度鑒定

10、：取培養(yǎng)至10d的海馬神經元細胞爬片，采用免疫熒光細胞化學方法進行鑒定，結果顯示：海馬神經元純度達93.1%。
　　3．神經元活性測定：MTS試劑盒測定細胞活性結果顯示，與CON組相比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組三組大鼠海馬神經元細胞活性下降，差異均具有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組海馬神經元細胞活性升高，差異有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉染組海馬神經

11、元細胞活性下降，差異無統(tǒng)計學意義。
　　4．病理學檢測：TUNEL法結果顯示，與對照組相比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組3組中凋亡的大鼠海馬神經元中數目增多，差異有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組凋亡的大鼠海馬神經元數目減少，差異有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉染組凋亡的大鼠海馬神經元數目增多，差異無統(tǒng)計學意義。
　　5．QT-PCR結果：與CON組相

12、比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組三組大鼠海馬神經元無鎂誘導后24h Miro1 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組，Miro1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rAd轉染組Miro1 mRNA水平升高，差異無統(tǒng)計學意義。
　　6．Western blot結果：與CON組比較，Miro1蛋白表達量在無鎂誘導后3h開始升高

13、，24h時達最高水平，差異有統(tǒng)計學意義；與CON組比較，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉染組和無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組三組大鼠海馬神經元無鎂誘導后24h Miro1水平均顯著升高，Bcl-2表達下降，caspase-3和Bax的激活均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組Miro1水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rAd轉染組Miro1水平升高，差異無統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rA

14、d-Miro1轉染組Bcl-2表達升高，Bax和caspase-3激活減少，差異均具有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉染組Bcl-2表達升高，Bax和caspase-3激活減少，差異均無統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1．無鎂誘導大鼠海馬神經元致癇后細胞內Miro1 mRNA及Miro1蛋白的表達水平均提高，提示線粒體移動可能參與癲癇病理損傷的過程；
　　2．Miro1蛋白介導的線粒體移動對癲癇發(fā)作后的大鼠海馬神經元具有保