miRNA-544a對上皮性卵巢癌生物學行為影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞、細胞間質、免疫炎癥細胞和腫瘤血管的共同作用有關，腫瘤生長、發(fā)展、轉移與侵襲不但與腫瘤細胞的遺傳突變有關，而且與腫瘤間質微環(huán)境有關。炎癥與腫瘤的關系主要研究一下兩方面:炎癥性細胞因子白介素-17的功能和信號轉導機制;Nod樣受體（病原和細胞應激識別受體）的功能及其信號轉導激活機制[4]。在上皮性卵巢癌的研究中發(fā)現，腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞（調節(jié)性T細胞:

2、Regulatory cells）可以通過IL-2轉化為CD4+IL-17+細胞，從而減輕Treg細胞介導的免疫抑制作用。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為18-25nt的非蛋白編碼小RNA，它通過結合靶基因mRNA的3'UT R而抑制基因的表達，表現為一種轉錄后調控基因表達的全新機制，在細胞發(fā)育、免疫應答、炎癥反應及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理與病理過程中均發(fā)揮重要調控作用。miRNA通過調控靶基因來發(fā)揮作用。
　

3、　miRNA在多種生物過程中起調節(jié)作用，如調節(jié)細胞周期、分化、增值、凋亡及血管形成。同一miRNA可以調節(jié)多個基因，同一個基因又可以受到多個不同miRNA的調節(jié)。多種miRNA影響卵巢癌的侵襲遷移能力。上皮間質化EMT為促進上皮細胞發(fā)生轉移的重要途徑[12-15]，表現為上皮性標志物E-cadherin下調，間質化標志物N-cadherin、ZEB1、ZEB2、Vimentin上調。miR-200/ZEB1雙向調控是EMT主要調節(jié)者之一

4、[16]，多項研究表明，卵巢癌中miRNA-200家族調控靶基因ZEB1和ZEB2。miR-506也是一種關鍵的EMT抑制基因，通過直接作用于靶基因SLUG(SNAI2)、vimentin和N-cadherin這些間質表型的關鍵分子發(fā)揮抑癌作用[17]。過表達miRNA-544a在胃癌中通過E-cadheri的減少，Vimentin上調促進EMT促進胃癌發(fā)展，作為WNT信號通路的主要成分的AXIN2和APC2為miR-544a的直接間接

5、靶基因，miR-544a誘導EMT[18]。在另一項研究中，上皮性卵巢癌細胞轉染EMT促進因子HMGA2降低了miR-15a，miR-18a，miR-22和miR-29b的水平而Let-7家庭成員表達高升高。靶基因與miRNA之間可以互相調控，實現在上皮和間質之間轉化。最近，microRNA被證明參與了正常的成纖維母細胞轉變?yōu)榘┌Y相關纖維細胞，通過對miRNA-31和miRNA-214和miR-155的下調，而趨化性因子CCL5被確定為

6、miR-214的靶基因，這表明在腫瘤微環(huán)境的調控中起到重要作用。其他重要的細胞過程如:缺氧和血管生成在卵巢癌中受miRNAs調控。miRNA-199A的3-UTR端相關靶基因HIF-1α和HIF-2α，在缺氧環(huán)境下，miRNA-199a的表達降低，導致了HIF的升高。miR-200的成員能夠通過抑制靶基因CXCL1和IL-8來抑制血管生成，降低惡性腫瘤形成。這給予我們提示，卵巢癌致病因素及過程并不是單一途徑，利用卵巢癌的致癌基因與miR

7、NA之間關系及miRNA致癌基因與腫瘤微環(huán)境中細胞因子、炎癥因子關系來調控降低卵巢癌發(fā)生轉移。
　　第一部分 炎性細胞因子在上皮性卵巢癌的表達及其相關性
　　研究目的:
　　通過檢測IL-17在上皮性卵巢腫瘤的表達，研究其與臨床特點的相關性，研究其與EMT的關系，探索其與卵巢癌診治及預后的關系。
　　研究方法:
　　收集山東大學齊魯醫(yī)院婦科自2013年1月至2015年12月收住院的卵巢惡性上皮性腫瘤術后組

8、織標本50例。均經病理診斷證實為惡性上皮性腫瘤，10例良性卵巢上皮性腫瘤組織及10例正常卵巢上皮組織作為對照。免疫組化檢測炎癥細胞因子IL-17A、IL-17D、上皮性標志物E-cadherin及間質性標志物Vimentin在卵巢惡性上皮性腫瘤組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織及正常卵巢上皮組織中的表達情況。分析細胞因子及上皮-間質標志物與臨床特點的相關性。
　　研究結果:
　　1.IL-17A的表達從實驗可見，切片染色后IL-1

9、7A呈棕黃色位于細胞漿IL-17D位于細胞膜及細胞漿，表現為淺黃色染色。IL-17A和IL-17D在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中強陽性表達，而卵巢良性上皮性腫瘤及正常卵巢上皮組織不表達。
　　2.通過免疫組化結果發(fā)現，50例惡性卵巢上皮性腫瘤被分為IL-17A陽性組及IL-17D陽性組。IL-17A及IL-17D在臨床分期晚期及腫瘤分化程度呈低分化組織中高表達，在病理類型上IL-17A及IL-17D表達統(tǒng)計學上沒有明顯差異。無腹水及腹

10、水量少于500ml及腹水超過500ml，IL-17A和IL-17D在二者表達率統(tǒng)計學上無明顯差異。IL-17A和IL-17D表達陽性率高組Vimentin表達陽性率也高，而E-cadherin表達陽性率低。
　　研究結論:
　　1.與正常卵巢組織及良性上皮性卵巢腫瘤組織相比較，上皮性卵巢癌組織中IL-17A、IL-17D及Vimentin陽性表達率高。而E-cadherin在上皮性卵巢癌中低表達，在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織

11、中陽性表達率高。
　　2.高臨床期別、低分化上皮性卵巢癌IL-17A、IL-17D及Vimentin高表達。而E-cadherin表達陽性率低。腹水的量及上皮性卵巢癌組織類型的表達陽性率無明顯差別。
　　3.這一結果推測炎癥細胞因子及間質化標志物共同促進卵巢癌侵襲性轉移性。
　　第二部分 miRNA-544a在卵巢癌中的表達及對卵巢癌的生物學行為研究
　　研究目的:
　　通過RT-PCR檢測miRNA-5

12、44a在正常卵巢上皮組織及上皮性卵巢癌組織中的mRNA表達，正常卵巢上皮細胞及卵巢癌細胞系A2780、HO8910、SKOV3中miRNA-544a的表達，研究其與臨床特點的相關性，探索其與卵巢癌轉移侵襲性的關系。通過在卵巢癌細胞株中分別過表達miRNA-544a mimics，檢測miRNA-544a對卵巢上癌細胞的遷移侵襲性影響，并通過RT-PCR及Western blot檢測過表達后細胞中的E-cadherin(CDH1)和Vim

13、entin的mRNA及蛋白表達水平，以判斷miRNA-544a促進卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制。
　　研究方法:
　　收集山東大學齊魯醫(yī)院婦科自2015年11月至2016年11月收住院的卵巢惡性上皮性腫瘤術后組織標本36例，均經病理檢查診斷為惡性上皮性腫瘤。13例正常卵巢上皮組織。RT-PCR檢測miRNA-544a在正常卵巢上皮組織及上皮性卵巢癌組織中的mRNA相對表達量，上皮性標志物E-cadherin及間質性標志物Viment

14、in的mRNA水平在卵巢惡性上皮性腫瘤、正常卵巢上皮組織中的表達情況。采用免疫印跡法，檢測隨機抽取3例卵巢癌組織及正常卵巢組織E-cadherin及Vimentin的蛋白表達情況。Transewell小室遷移侵襲實驗檢測過表達miRNA-544a對卵巢癌細胞遷移侵襲性的影響。RT-PCR檢測在轉染miRNA-544amimics后上皮性卵巢癌細胞中的CDH1和Vimentin的mRNA水平相對表達量，免疫印跡檢測轉染后卵巢癌細胞中E-c

15、adherin和Vimentin的蛋白表達水平。
　　研究結果:
　　1.miRNA-544a mRNA水平在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中顯著升高，而正常卵巢上皮組織中低表達。
　　2.miRNA-544a mRNA水平在正常人卵巢上皮細胞HOSepiC中低表達，上皮性卵巢癌細胞A2780、HO8910、SKOV3中高表達。
　　3.在免疫印跡實驗中:檢測隨機抽取3例卵巢癌組織及正常卵巢組織，檢測癌組織中E-cadh

16、erin的蛋白水平表達低于正常卵巢組織中的蛋白水平，而Vimentin在癌組織中蛋白水平高于正常卵巢組織的蛋白水平。
　　4.Transwell小室實驗發(fā)現miRNA-544a過表達有促進卵巢癌細胞遷移侵襲性的能力。
　　5.RT-PCR檢測在轉染miRNA-544amimics后上皮性卵巢癌細胞中的CDH1mRNA水平下調而Vimentin的mRNA水平上調。
　　6.在免疫印跡實驗中，上調miRNA-544a后檢測

17、癌細胞中E-cadherin的蛋白水平表達降低，而Vimentin蛋白表達水平升高。
　　研究結論:
　　1.與正常卵巢組織相比較，上皮性卵巢癌中miRNA-544a mRNA及Vimentin mRNA水平高表達。而E-cadherin的mRNA及蛋白水平在上皮性卵巢癌中低表達。正常卵巢上皮細胞及正常卵巢組織中miRNA-544a低表達，E-cadherin的mRNA水平及蛋白水平高表達，Vimentin的mRNA及蛋白水