CXCR1-2拮抗劑G31P聯(lián)合GDCO941對乳腺癌治療的增強作用.pdf

1、目的:趨化因子是一種主要由免疫細胞、某些基質細胞和腫瘤細胞等多種細胞分泌的可結合在內皮細胞表面、對中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等不同細胞具有趨化和激活作用的細胞因子。CXC趨化因子在炎癥反應、血管形成過程和腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，CXCR1/2通過與配體的結合，激活胞內下游信號通路，除了趨化、活化免疫細胞外，也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移，病原微生物感染以及移植排斥反應等病理過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)IL-8在多種腫瘤細胞中過表達，促進

2、腫瘤的血管生成、侵襲和轉移等。G31P是我實驗室通過點突變法人工構建得到的對受體CXCR1/2親和力高于CXCL-8，但無生物學趨化活性的CXCL-8衍生物，競爭性抑制包括IL-8在內的多種趨化因子與CXCR1/2的結合，G31P通過阻斷CXCL-8等細胞因子的生物學作用抑制血管生成，從而影響腫瘤的生長、轉移，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。GDC-0941是一種口服、有效且特異性的PI3K/Akt/mTOR選擇性抑制劑，能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導

3、腫瘤細胞凋亡和抑制中心母細胞數。目前處于臨床試驗階段，具有療效好、毒副作用低、患者耐受性好等優(yōu)點。本實驗通過GDC-0941與G31P的聯(lián)合用藥，研究聯(lián)合用藥對人乳腺癌細胞的抑制作用，為腫瘤的臨床治療提供新的思路。
　　方法:體外實驗:HCC1954、BT474和4T1細胞體外培養(yǎng)，分組加藥處理。檢測方法:細胞劃痕實驗，檢測聯(lián)合應用GDC-0941和G31P對腫瘤細胞遷移能力的影響;蛋白質印跡法，檢測聯(lián)合用藥對腫瘤細胞中cl-PA

4、RP、bcl-2和pS6蛋白的表達情況;克隆形成實驗，檢測聯(lián)合用藥對腫瘤細胞成瘤以及增殖能力的影響;細胞活性實驗，檢測聯(lián)合用藥對腫瘤細胞存活能力的影響;細胞侵襲實驗，檢測聯(lián)合用藥對于腫瘤細胞侵襲能力的影響;細胞周期檢測，檢測聯(lián)合用藥對細胞周期分布的影響。體內實驗:動物模型建立:BALB/C雌性小鼠背部三處乳墊接種接種5×104個4T1細胞，于接種腫瘤第10天，小鼠隨機分為4組，包括GDC-0941+G31P組、GDC-0941組、G31

5、P組和腫瘤對照(Control)組，每組8只。GDC-0941+G31P組小鼠和G31P組小鼠隔天腹腔注射G31P500μg/kg，其余各組同時注射等量生理鹽水。GDC-0941組和GDC-0941+G31P組小鼠每日灌胃給藥GDC-0941，130mg/kg，其余各組灌胃等量生理鹽水。標本處理:用藥第24天，小鼠全部處死，剝離實體腫瘤和肺組織。肺組織經固定處理后進行病理學檢測。
　　結果:(1)體外實驗:細胞劃痕實驗，GDC-0

6、941+G31P組劃痕“愈合”程度顯著低于其余三組，提示聯(lián)合用藥能抑制腫瘤細胞的遷移能力;蛋白質印跡法，結果顯示GDC-0941+G31P組cl-PARP蛋白表達較其余三組顯著增加、bcl-2和pS6蛋白表達較其余三組顯著降低，提示聯(lián)合用藥能促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增殖;克隆形成實驗，結果顯示GDC-0941組、G31P組、GDC-0941+G31P組克隆形成數與對照組相比都有不同程度減少，GDC-0941+G31P組克隆形成數目最少

7、(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥能增強GDC-0941單藥對腫瘤細胞克隆形成的抑制作用;細胞活性實驗，結果顯示，與對照組比較GDC-0941組存活細胞數量減少，G31P組無統(tǒng)計學差異，GDC-0941+G31P組存活細胞數顯著減少(p＜0.05)，提示聯(lián)合用藥能顯著增強GDC-0941對腫瘤細胞的殺傷作用;細胞侵襲實驗，結果顯示，與對照組相比GDC-0941組、G31P組和GDC-0941+G31P組結晶紫染色細胞數均有不同程度減少，其中

8、GDC-0941+G31P組細胞數最少(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤細胞的侵襲能力;細胞周期檢測，結果顯示GDC-0941組和G31P組的細胞周期分布與對照組無顯著差異，GDC-0941+G31P組S期細胞數明顯增多(p＜0.05)，提示聯(lián)合用藥能抑制腫瘤細胞進入G2/M期，抑制細胞增殖。
　　(2)體內實驗研究顯示，GDC-0941聯(lián)合G31P可明顯抑制腫瘤生長，GDC-0941+G31P組腫瘤平均體積188.4±2

9、3.32mm3，明顯小于腫瘤組（685.6±109.5）(p＜0.01)，小于單獨應用GDC-0941組（461.2±50.70mm3）(p＜0.01)和單獨應用G31P組（496±46.75mm3）(p＜0.01)，提示聯(lián)合用藥能顯著抑制小鼠乳腺癌實體瘤體積的增長;肺部轉移瘤數量以及HE染色顯示，聯(lián)合用藥能有效抑制小鼠乳腺癌向肺部轉移;小鼠體重顯示四組之間無顯著差異，提示聯(lián)合用藥的毒副作用可耐受。
　　結論:(1)GDC-094

10、1聯(lián)合應用G31P能明顯抑制小鼠乳腺癌細胞的生長，效果強于單獨應用GDC-0941和G31P。
　　(2)GDC-0941聯(lián)合應用G31P生物學毒性可耐受，相比單獨應用GDC-0941和G31P毒副作用無明顯增加。
　　(3)GDC-0941聯(lián)合應用G31P有效抑制乳腺癌的轉移，效果強于單獨應用兩種藥物，提高小鼠生存率和生命質量。
　　(4)GDC-0941聯(lián)合應用G31P，相較于單獨應用兩種藥物，更有效的抑制了腫瘤細