藠頭凝集素蛋白的分離純化、克隆表達及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、凝集素是一類具有一個或多個可與單糖或寡糖可逆特異性結合的非催化結構域的蛋白質，在動物、植物和微生物中廣泛存在。植物凝集素在病原菌防御、細胞識別、細胞生長控制、胞內物質運輸等多種生理生化現象中具有重要作用。
　　 本文以傳統(tǒng)的藥食兩用蔥屬植物——藠頭(Allium chinense)為材料，通過分離純化得到一種藠頭凝集素(Allium chinense lectin，ACL)蛋白，并進行了鑒定、克隆和重組表達及抗腫瘤活性研究。

2、r>　　 采用磷酸緩沖液(PBS，pH7.3)對研磨的新鮮藠頭鱗莖進行抽提，飽和硫酸銨沉淀法進行粗分離，然后經Q Sepharose強陰離子交換色譜和Superdex200葡聚糖凝膠色譜分離得到SDS-PAGE單一條帶蛋白，質譜鑒定結果顯示該蛋白可能為一種甘露糖結合凝集素。血凝活性研究表明ACL對兔血紅細胞凝集活性高，熱穩(wěn)定性較好，在極端酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，且僅有甘露糖對ACL的凝集作用具有抑制效果。
　　 Trizol法提取藠

3、頭總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板，根據已知蔥屬植物凝集素基因保守區(qū)序列設計引物，PCR擴增獲得約320 bp片段，參照hiTAIL-PCR方法擴增其側翼序列，根據所得3’端和5’端序列設計特異引物，PCR獲得該基因ORF序列，共456 bp，編碼151個氨基酸。根據核苷酸序列推導氨基酸序列，可知ACL中包含3個已知的甘露糖結合位點QDNY，進一步驗證ACL為甘露糖特異性結合凝集素。利用BLAST對核苷酸和氨基

4、酸序列分別進行同源性比對分析，結果顯示，該基因與其它凝集素核苷酸序列同源性介于76％-91％，氨基酸序列同源性在47％-89％。本研究構建了大腸桿菌重組表達質粒pET28a-ACL并轉化E.coli BL21(DE3)，成功得到ACL融合蛋白，HisTrap親和色譜純化融合蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體，為深入研究ACL與腫瘤細胞的相互作用機制提供了基礎。
　　 天然和重組ACL分別作用于人肝癌細胞(Hep-3B)和人臍帶靜脈內皮

5、細胞(HUVEC)，MTT實驗結果表明，native-ACL和recombinant-ACL都能明顯抑制Hep-3B細胞增殖、降低腫瘤細胞活性，且native-ACL對HUVEC細胞增殖無顯著影響。DNA片段化實驗中，native-ACL處理組Hep-3B細胞DNA在瓊脂糖凝膠檢測時出現明顯“梯狀”條帶。經DAPI、tubulin Alexa Fluor488和Mito TrackerRed CMVRos分別對細胞進行免疫熒光染色后在激

6、光共聚焦顯微鏡下檢測，結果顯示native-ACL處理后Hep-3B細胞形態(tài)和結構上都發(fā)生了變化:細胞皺縮成圓形，細胞核呈現多形化，微管蛋白凝聚導致細胞骨架破壞，線粒體跨膜電位出現崩解。而native-ACL處理HUVEC細胞和未處理的陰性對照組細胞形態(tài)、細胞骨架等都沒有明顯差異。同時，利用anti-ACL一抗和熒光染料偶聯的二抗對native-ACL在細胞中的定位進行，結果表明在ACL處理后的細胞胞漿中熒光明顯，說明native-AC