銅綠假單胞菌對(duì)微生物的抑制作用及機(jī)理探討.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 銅綠假單胞菌藥物敏感性試驗(yàn)及流行病學(xué)分析
　　目的：
　　了解同濟(jì)醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌基因型及耐藥情況，為抗生素的合理使用及感染控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　收集同濟(jì)醫(yī)院2012年6月-2012年8月從臨床感染患者標(biāo)本中分離鑒定得到的60株銅綠假單胞菌，采用Kirby-bauer法對(duì)60株銅綠假單胞菌的耐性情況進(jìn)行分析；用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（Mul

2、tillocus sequence typing,MLST），以銅綠假單胞菌7個(gè)管家基因acsA、aroE、guaA mutL、nuoD、ppsA和trpE的內(nèi)部特定核酸片段作為檢測(cè)的靶基因，對(duì)60株銅綠假單胞菌的靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Pseudomonas aeruginosa MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，最終確定這60株銅綠假單胞菌的基因型；通過(guò)eBURST方法對(duì)這60株銅綠假單胞菌進(jìn)行進(jìn)化聚類(lèi)分析，同時(shí)通過(guò)Split

3、sTree軟件進(jìn)行菌株基因遺傳進(jìn)化分析。并使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析差異顯著性。
　　結(jié)果：
　　60株銅綠假單胞菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥率均較高，耐藥率由高到低依次是：米諾環(huán)素(MH)（100.0％）、哌拉西林(PIP)(55.0％)、左氧氟沙星(LEV)(51.6％)、亞胺培南(IPM)(48.3％)、慶大霉素(GN)(48.3％)、頭孢哌酮(CFP)(48.3％)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)(46.6％)、美洛培南(MEM)

4、(46.6％)、環(huán)丙沙星(CIP)(45.0％)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)(45.0％)、頭孢吡肟(FEP)(43.3％)、氨曲南(ATM)(43.3％)、阿米卡星(AK)(38.3％)和頭孢他啶(CAZ)(15.0％)。其中9株對(duì)所測(cè)試的14種抗生素全部耐藥。MLST分析顯示60株銅綠假單胞菌可分為11個(gè)ST型，即ST262、ST195、ST767、ST274、ST527、ST849、ST639、ST871、ST244、ST636

5、和ST645型，未發(fā)現(xiàn)新的型別；其中ST244和ST274是優(yōu)勢(shì)ST型別，分別占26.67％(16/60),18.33％(11/60)；且ST244型在ICU及呼內(nèi)科數(shù)量顯著高于其它科室（p<0.05）。ST244、ST274型在碳青霉烯類(lèi)藥物不敏感組中所占比例要顯著高于在碳青霉烯類(lèi)藥物敏感組中所占比例（p<0.05）,其它ST型與藥物敏感性試驗(yàn)無(wú)相關(guān)性（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　60株銅綠假單胞菌耐藥性較為嚴(yán)重，并

6、出現(xiàn)9株全耐株。本地區(qū)以ST244和ST274為優(yōu)勢(shì)克隆株，尤其在ICU及呼內(nèi)科數(shù)量顯著高于其它科室，提示醫(yī)院內(nèi)存在小范圍的傳播。ST244和ST274型與耐藥性的關(guān)系尚不能確定，需作進(jìn)一步研究。
　　第二部分 銅綠假單胞菌對(duì)其它微生物的抑制作用觀察
　　目的：
　　觀察臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)微生物的抑制作用，為抗感染治療藥物研發(fā)提供線(xiàn)索。
　　方法：
　　采用紙片法觀察臨床分離銅綠假單胞菌對(duì)金黃色葡萄球

7、菌ATCC25923及對(duì)白色念珠菌ATCC90028的抑制作用，在抑菌作用最強(qiáng)和無(wú)抑菌作用的銅綠假單胞菌中各選擇2株菌(PA1206、PA1246和PA1201、PA1222)用于進(jìn)一步研究。通過(guò)紙片法、十字征劃痕實(shí)驗(yàn)和共孵育實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這4株銅綠假單胞菌對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌（包括MRSA,VISA及MRSA）、革蘭陽(yáng)性桿菌、革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陰性球菌及真菌的抑制作用；觀察溫度、pH值、孵育時(shí)間、碳源及氮源對(duì)銅綠假單胞菌抑菌作用的影響。建立小

8、鼠共感染模型觀察銅綠假單胞菌對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抑制作用。
　　結(jié)果：
　　PA1206和PA1246對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌(包括MRSA,VISA及MRSA)、革蘭陽(yáng)性桿菌、革蘭陰性雙球菌、真菌具有顯著抑制作用,抑制率為100％，對(duì)革蘭陰性桿菌則無(wú)抑制作用，PA1201和PA1222對(duì)上述指示菌均無(wú)作用。在影響因素中，銅綠假單胞菌孵育后24小時(shí)后培養(yǎng)物在4℃到121℃之間時(shí)顯示對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923抑制作

9、用沒(méi)有明顯改變。pH值為7時(shí)抑制作用最強(qiáng)，而pH=4,pH=10時(shí)，抑制作用喪失。在麥芽糖(maltose)和可溶性淀粉(starch soluble)作碳源時(shí)，抑制作用相對(duì)減弱,使用其它碳源時(shí)抑制作用較強(qiáng)。在使用氮源時(shí)， L-天冬酰胺(asparaginate),磷酸銨(ammonium phosphate)能完全抑制銅綠假單胞菌的活性成分的產(chǎn)生，使它對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用完全喪失。硝酸胺(ammonium ni

10、trate),硝酸鈉(sodium nitrate)則能部分的抑制銅綠假單胞菌對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制作用。硝酸鉀(Potassium nitrate),硫酸銨(ammonium sulfate),氯化銨(ammonium chloride)作為氮源時(shí)銅綠假單胞菌的抑菌作用最強(qiáng)。孵育時(shí)間顯示，第1天到第12天殺滅作用逐漸增強(qiáng)，第12天至第15天抑制作用逐漸減弱。銅綠假單胞菌與白色念珠菌（或金黃色葡萄球菌）共感染模型顯示，

11、在小鼠體內(nèi)對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌也具有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　銅綠假單胞菌對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌，革蘭陽(yáng)性桿菌，革蘭陰性球菌及真菌有殺滅或抑制作用，而對(duì)革蘭陰性桿菌則幾乎沒(méi)有作用。pH值、碳源及氮源、孵育時(shí)間的改變可影響其抑制作用。銅綠假單胞菌在體內(nèi)對(duì)其它微生物也具有抑制作用。對(duì)臨床上比較棘手的MRSA、VISA、MRSCN及真菌感染可能提供新的治療途徑。
　　第三部分 銅綠假單胞菌對(duì)微生物抑制作用機(jī)制研究
　

12、　目的：
　　探討銅綠假單胞菌對(duì)其它微生物抑制作用的機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)針對(duì)微生物感染的治療方法。
　　方法：
　　脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析這四株銅綠假單胞菌的同源性。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析這4株菌在分泌蛋白上的差異。通過(guò)對(duì)4株菌的培養(yǎng)物進(jìn)行氯仿粗提后，運(yùn)用薄層液相色譜(TLC)，放射自顯影分析其活性成分組分，分析型高效液相色譜對(duì)粗提物進(jìn)行分析，硅膠柱對(duì)粗提物進(jìn)行初步分純，再通過(guò)制備型高效液相對(duì)初步分純物各

13、主峰洗脫液進(jìn)行收集純化，得到有效主峰洗脫液成分，純化后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)質(zhì)譜分析其分子量大小。
　　結(jié)果：
　　PFGE顯示這四株菌來(lái)源各不相同。SDS-PAGE顯示有抑制作用的PA1206和PA1246在分泌蛋白上與無(wú)抑制作用的PA1201和PA1222存在明顯差異。氯仿粗提物顯示，PA1201和PA1222顏色呈綠色，PA1206和PA1246呈深棕色。銅綠假單胞菌PA1206和PA1246粗提物顯示有抑制作用，而PA

14、1201和PA1222粗提物則沒(méi)有作用。粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離初步純化及制備型高效液相進(jìn)一步分離純化后，采用質(zhì)譜分析確認(rèn)PA1206和PA1246主要活性成分為4種小分子類(lèi)物質(zhì)。這可能是與PA1201和PA1222產(chǎn)生不同作用的主要機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　有抑制和殺滅作用的銅綠假單胞菌是通過(guò)產(chǎn)生特異分泌性蛋白，或小分子物質(zhì)來(lái)抑制其它微生物，沒(méi)有作用的銅綠假單胞菌則不產(chǎn)生這些小分子物質(zhì)或蛋白。此二株有很強(qiáng)活性的菌株代謝產(chǎn)物有可