鸚鵡熱衣原體持續(xù)性感染經(jīng)Bcl-2家族蛋白和ERK抑制HeLa細(xì)胞凋亡.pdf

1、背景與目的：細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除病原微生物感染的重要防御機(jī)制。本課題組的前期研究表明鸚鵡熱衣原體（Cps）感染HeLa細(xì)胞后，可通過抑制其凋亡而發(fā)揮持續(xù)性感染，但其機(jī)制尚不明確，本研究旨在觀察人重組干擾素-γ（rhIFN-γ）誘導(dǎo)Cps6BC持續(xù)感染條件下，觀察其對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從而初步闡明Cps持續(xù)性感染對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，加入MOI為2的Cps6BC菌株和35ng/mL rh

2、IFN-γ誘導(dǎo)持續(xù)性感染，分別于感染后0、4、8、12、24h收集細(xì)胞進(jìn)行Hochest33258和TUNEL熒光染色觀察HeLa細(xì)胞凋亡情況；采用間接免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)（IFA）檢測(cè)核形態(tài)以及細(xì)胞色素c（Cyt.C）和線粒體膜電位（MMP）的變化，同時(shí)采用Western blot檢測(cè)Cps持續(xù)性感染對(duì)HeLa細(xì)胞中Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3、Cyt.C、tBid、Bad、Bim、Mcl-1表達(dá)水平及ERK磷酸

3、化的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）Cps6BC持續(xù)性感染HeLa細(xì)胞0、4、8、12、24h，Hochest33258和TUNEL染色結(jié)果顯示其凋亡率明顯降低，但感染24h后凋亡率有所增高但仍低于對(duì)照水平；
　　（2）而Cps持續(xù)性感染20h后能顯著抑制STS對(duì)HeLa凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)，形態(tài)學(xué)上Cps持續(xù)感染的細(xì)胞核與正常HeLa細(xì)胞核大小、形態(tài)無明顯差異；
　?。?）Cps持續(xù)感染4h后Caspase3表達(dá)逐漸增

4、加，而其活性形式（Cleaved Caspase3）隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；
　?。?）未感染細(xì)胞Mcl-1和Bad表達(dá)較低。Cps持續(xù)性感染4h后，Mcl-1逐漸增加，并持續(xù)至24h。而Cps持續(xù)性感染4h后，胞內(nèi)Bad表達(dá)明顯增高，但在4～24h內(nèi)呈恒定表達(dá)；
　　（5）Cps持續(xù)感染4h后，可顯著抑制CCCP誘導(dǎo)HeLa釋放Cyt.C，并持續(xù)至24h；此外，Cps持續(xù)性感染后也能一定程度削弱CCCP對(duì)MMP的影響；<

5、br>　?。?）隨著Cps持續(xù)性感染時(shí)間的延長(zhǎng)，HeLa細(xì)胞BimEL水平隨之降低，Bims表達(dá)增高。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)tBid、Cyt.C的表達(dá)水平也隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少；
　　（7）隨持續(xù)性感染時(shí)間的延長(zhǎng)，HeLa細(xì)胞內(nèi)Fas及其配體Fas-L的表達(dá)水平逐漸減少。細(xì)胞內(nèi)Caspase8,其活性形式Cleaved Caspase8含量也隨持續(xù)性感染時(shí)間延長(zhǎng)而降低；
　?。?）Cps持續(xù)性感染4～24h，磷酸化ERK水平隨著