Cx43、Cx45在豚鼠慢性結(jié)石性膽囊炎模型中的表達(dá)及茵陳蒿湯的干預(yù)作用研究.pdf

1、背景：
　　膽囊作為構(gòu)成膽道系統(tǒng)的重要部分，主要用于濃縮儲(chǔ)存膽汁和排出膽汁。而慢性結(jié)石性膽囊炎屬于膽道動(dòng)力功能減弱性疾病。隨著 Hinescu ME[1]首次發(fā)現(xiàn)Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）在膽道中存在后，也為今后研究膽道動(dòng)力發(fā)生機(jī)制提供了一個(gè)指引方向。
　　ICC在胃腸道上的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展比在膽道動(dòng)力上要更加深入。根據(jù)研究表明，ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞[2]，調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的節(jié)律，也是胃腸正常運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)條件?？p

2、隙連接蛋白43、45（Connexin43、45，Cx43、Cx45）是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接(GJ)通道的基本結(jié)構(gòu)和功能的一大類膜蛋白中分布相對(duì)較廣泛的兩種蛋白[3]。而GJ是相鄰細(xì)胞間進(jìn)行小分子物質(zhì)及電化學(xué)信號(hào)傳遞的特殊通道，具有調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞的協(xié)同反應(yīng)。隨著ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)研究的進(jìn)展，已有相關(guān)研究表明Cx43、Cx45存在于胃腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）與平滑肌細(xì)胞（SMC）之間[1]，通過(guò)構(gòu)成GJ進(jìn)而參與胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。而膽囊的壁

3、層結(jié)構(gòu)與胃腸道的壁層結(jié)構(gòu)相似，膽囊ICC和胃腸ICC的超微結(jié)構(gòu)同樣具有相似之處，膽囊中是否也有Cx43、Cx45的表達(dá)，是否與胃腸道中Cx43、Cx45和ICC之間的關(guān)系相似，參與膽道動(dòng)力的調(diào)節(jié)不得而知。我們從這個(gè)角度來(lái)研究Cx43、Cx45和ICC在膽囊運(yùn)動(dòng)中的關(guān)系及相關(guān)作用。
　　茵陳蒿湯作為在經(jīng)方中治療陽(yáng)黃的經(jīng)典方，主要用于清熱除濕、疏肝利膽和其他病癥的治療[4、5]，在治療慢性結(jié)石性膽囊炎有著十分顯著的功效。本課題組研究發(fā)

4、現(xiàn)[6]，其在治療慢性結(jié)石性膽囊炎中ICC的數(shù)量較病變時(shí)顯著提高，為加深了解該藥與慢性結(jié)石性膽囊炎之間和膽囊ICC之間的關(guān)系，需通過(guò)細(xì)胞層面近一步的研究。
　　目的：
　　第一部分：通過(guò)病例分析，茵陳蒿湯對(duì)慢性結(jié)石性膽囊炎患者中膽囊收縮功能的影響。
　　第二部分：本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠高膽固醇的致石飼料的方法[21]，建立慢性結(jié)石性膽囊炎的慢性模型，并在8周后給予治療組中藥茵陳蒿湯灌胃。各組分別對(duì)膽囊通過(guò)HE染色

5、、免疫組化及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法，觀察各組膽囊ICC的數(shù)量及形態(tài)的變化，各組膽囊中Cx43、Cx45蛋白與ICC的表達(dá)變化。探討Cx43、Cx45與ICC之間的相關(guān)作用，以及茵陳蒿湯對(duì)膽囊中Cx43、Cx45和ICC的影響。
　　方法：
　　第一部分：
　　1.選取大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院近兩年的慢性結(jié)石性膽囊炎患者，按照該疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)篩選，隨機(jī)分為茵陳蒿湯治療組和清熱利膽顆粒治療組，同時(shí)

6、選取無(wú)相關(guān)膽道系統(tǒng)疾病的志愿者作為對(duì)照組，一同進(jìn)行研究。
　　2.通過(guò)B超測(cè)定各組膽囊收縮率指標(biāo)，將上述數(shù)據(jù)錄入數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察患者與對(duì)照組人員上述指標(biāo)的差異以及患者治療前后上述指標(biāo)的變化。
　　第二部分：
　　1.選取實(shí)驗(yàn)用普通級(jí)豚鼠，均為雄性，3-4個(gè)月齡，體重250-300克，之后隨機(jī)分組，分為三個(gè)組正常組、模型組和治療組。進(jìn)行分組喂養(yǎng)，正常組豚鼠喂食正常豚鼠合成飼料，同時(shí)模型組和治療組喂食經(jīng)過(guò)上文

7、的配制方法，配制好的致石飼料，飼養(yǎng)周期為8周。8周后，給治療組以茵陳蒿湯灌胃。正常組和模型組使用同體積生理鹽水替代中藥做對(duì)照，并繼續(xù)之前的飼養(yǎng)計(jì)劃，一共施行4周。
　　2．分別取各組膽囊，行冰凍切片，經(jīng)過(guò)固定、脫水、染色等步驟進(jìn)行HE染色，并在光鏡下觀察各組膽囊的病理學(xué)變化，之后經(jīng)過(guò)獨(dú)立雙盲原則請(qǐng)病理科老師進(jìn)行評(píng)定，驗(yàn)證模型建立是否成功。
　　3.分別取各組膽囊組織，通過(guò)固定、包埋、孵育等免疫組化步驟和免疫熒光雙標(biāo)免疫步驟后

8、，封片保存，觀察各組膽囊肌層中 Cx43、Cx45的表達(dá)數(shù)量以及與ICC之間的關(guān)系，并采集有用圖像，分析平均光密度值。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.茵陳蒿湯和清熱利膽顆粒兩組藥物治療前分別與對(duì)照組相比膽囊收縮率顯著下降（P<0.05），其膽囊收縮功能表現(xiàn)為不良狀態(tài)。
　　2.茵陳蒿湯和清熱利膽顆粒兩組藥物治療后分別與其治療前相比較膽囊收縮率顯著提高（P<0.05），可知兩種藥物都有顯著提高膽囊收縮功能。<

9、br>　　3.茵陳蒿湯和清熱利膽顆粒兩組藥物治療后對(duì)比兩組無(wú)明顯差別（P>0.05）但茵陳蒿湯相較明顯。
　　第二部分：
　　1. HE染色顯示，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織結(jié)構(gòu)的變化，模型組中粘膜上皮細(xì)胞排列紊亂，有上皮脫落，粘膜下肌層水腫代償性肥大，可見大量淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示，在膽囊肌層中有Cx43、Cx45的表達(dá)，呈褐黃色。模型組Cx43、Cx45的表達(dá)數(shù)量及顏色較正常組有顯著下降（P<0.05），

10、治療組Cx43、Cx45的表達(dá)數(shù)量及顏色較模型組顯著提高（P<0.05）。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示，模型組與正常組相比較，Cx43、Cx45和ICC表達(dá)的熒光強(qiáng)度顯著降低（P<0.05）；治療組與模型組比較，Cx43、Cx45和ICC表達(dá)的熒光強(qiáng)度有明顯提高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在膽囊肌層組織中存在Cx43、Cx45蛋白，并且在慢性結(jié)石性膽囊炎中Cx43、Cx45的表達(dá)有顯著下降。茵陳蒿湯治療后，有