化瘀解毒中藥調控NLRP3炎癥小體信號通路抑制細胞焦亡(Pyroptosis)的實驗研究.pdf

1、第一部分：化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細胞浸潤和炎性因子表達的影響
　　目的：觀察梗阻性腎病模型大鼠一般情況、腎臟病理改變、梗阻側腎臟炎性細胞浸潤等，同時觀察血液及梗阻側腎臟白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等炎性因子變化，探索化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟炎性細胞浸潤及炎性因子表達的影響，為化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷提供實驗依據(jù)。

2、r>　　方法：
　　1.動物分組和模型制備：40只SD雄性大鼠以隨機數(shù)字表法隨機分為假手術（Sham）組、模型（UUO）組、依普利酮（EPL）組及中藥（TCM）組，每組10只。采用單側輸尿管結扎手術復制梗阻性腎病大鼠模型。假手術組僅游離而不結扎輸尿管。
　　2.藥物干預：術后經口給藥， EPL組大鼠給予依普利酮100mg/（kg·d）；TCM組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/（kg·d）；Sham組及UUO組給予等容量生理鹽

3、水。每天1次，連續(xù)10天。干預結束后斷頭取血，摘取左側腎臟，部分組織多聚甲醛固定，其余組織-70℃保存。
　　3.檢測指標與方法：觀察大鼠一般狀況；記錄飲水量及進食量；測量24h尿量；稱取體質量、梗阻側腎質量，并計算腎臟指數(shù)（KI）；全自動生化分析儀檢測血清肌酐（SCr）、尿肌酐（UCr）、血清尿素（SUr），并計算肌酐清除率（Ccr）；HE染色觀察腎組織炎性細胞浸潤；SABC法檢測腎臟巨噬細胞 F4/80的表達；放射免疫法檢測血

4、清 IL-1β、IL-18、TNF-α含量；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清 MCP-1含量；Real time-PCR檢測腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1表達；SABC法和Western blot檢測IL-1β蛋白表達。
　　4.統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用（x±S）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　

5、　1.各組大鼠一般情況、體質量、腎質量及KI比較：Sham組進食量、飲水量穩(wěn)定，體質量增長穩(wěn)定，反應敏捷。各造模組大鼠進食量、飲水量均有所下降，體質量增長緩慢，反應能力減弱。UUO術后10天，與Sham組相比，UUO組大鼠體質量下降（P＜0.05）、梗阻側腎臟增大，腎質量明顯增加（P＜0.01）、梗阻側KI亦明顯上升（P＜0.01）；與UUO組相比， EPL組及TCM組大鼠的梗阻側腎質量明顯下降（P＜0.05）、體質量有所增加、梗阻側K

6、I亦有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.各組大鼠腎功能比較：與Sham組相比，UUO組SCr、SUr未見明顯升高，Ccr未見明顯降低（P＞0.05）；與UUO組相比，EPL組及TCM組各指標未見明顯變化（P＞0.05）。
　　3.各組大鼠腎間質炎性細胞浸潤情況比較：HE染色顯示，Sham組大鼠腎臟結構基本正常，腎間質偶見炎性細胞浸潤；UUO組大鼠輸尿管擴張，腎間質炎性細胞浸潤明顯增多，腎小管上皮細胞變性、濁

7、腫甚至壞死；EPL組及TCM組大鼠輸尿管擴張、腎小管上皮細胞亦有變性與濁腫，但炎性細胞浸潤明顯減輕。
　　4.各組大鼠腎組織 F4/80表達比較：Sham組大鼠腎間質僅見少量F4/80陽性細胞；UUO組F4/80陽性細胞浸潤明顯增多，主要表達于髓質；EPL及中藥組可見到陽性細胞，但較UUO組明顯減少。
　　5.各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α及MCP-1含量比較：與Sham組大鼠比較，UUO組血清IL-1β、I

8、L-18、TNF-α、MCP-1含量明顯升高（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組血清IL-1β、TNF-α、MCP-1含量明顯降低（P＜0.01）、IL-18亦有下降趨勢（P＞0.05）；與UUO組大鼠比較，TCM組血清IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P＜0.01），MCP-1含量降低（P＜0.05），IL-18含量亦有下降趨勢（P＞0.05）。
　　6.各組大鼠腎臟IL-1β、TNF-α、MCP-1 mRNA表達比

9、較：與Sham組大鼠比較，UUO組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達明顯升高（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組和TCM組腎組織IL-1β、TNF-α、MCP-1表達明顯降低（P＜0.01）。
　　7.SABC法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達比較：Sham組腎組織IL-1β呈弱表達，UUO組IL-1β主要表達于腎小管上皮細胞胞漿。與Sham組大鼠比較，UUO組腎組織IL-1β表達明顯增強；與UUO組大鼠比較

10、， EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達明顯減弱。
　　8.Western Blot法檢測各組大鼠腎臟IL-1β蛋白表達比較：UUO組大鼠腎組織IL-1β表達明顯高于Sham組（P＜0.01）；與UUO組大鼠比較，EPL組和TCM組腎組織IL-1β表達明顯降低（P＜0.01）。
　　第二部分：化瘀解毒中藥對梗阻性腎病大鼠腎臟細胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎癥小體信號通路的影響
　　目的：觀察梗阻性腎病模

11、型大鼠腎臟NLRP3介導的細胞焦亡改變；觀察化瘀解毒中藥對梗阻性腎病時 NLRP3-Caspase-1-IL-1β軸以及NLRP3-Caspase-1-Pyroptosis通路的影響；同時探討梗阻性腎病NF-κB與NLRP3信號通路的關系以及化瘀解毒中藥的影響；從而明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機制，并尋找其作用靶點。
　　方法：
　　1.動物分組、模型制備及藥物干預方法同第一部分。
　　2.檢測指標與方法：TUN

12、EL染色檢測腎臟組織細胞DNA損傷情況；HE染色觀察腎臟損傷細胞的形態(tài)；Real time-PCR檢測腎臟 NLRP3、Caspase-1、 IL-1β及 NF-κB mRNA表達；SABC法檢測腎臟 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β蛋白表達并定位；Western blot法檢測腎臟NLRP3、Caspase-1、 IL-1β及NF-κB蛋白表達并定量。
　　3.統(tǒng)計學處理同第一部分。
　　結果：
　　1.

13、各組大鼠腎臟組織細胞TUNEL染色陽性率比較：Sham組僅見少量TUNEL陽性細胞。與Sham組比較，UUO組細胞陽性率升高，以髓質擴張的遠端小管上皮細胞為主（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組和TCM組的遠端小管TUNEL陽性細胞減少，陽性率降低（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.UUO誘導的腎臟細胞損傷表現(xiàn)為多種病理形態(tài)：胞核固縮或斷裂，胞膜無明顯變化，為凋亡（Apoptosis）細胞形態(tài)特征；胞核固縮或斷裂，胞漿

14、腫脹，胞膜不完整，為焦亡（Pyroptosis）細胞形態(tài)特征；胞核腫脹或溶解，胞漿腫脹，胞膜不完整，為壞死（Necrosis）細胞形態(tài)特征。
　　3.各組大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1 mRNA表達比較：與Sham組比較，UUO組腎臟NLRP3、Caspase-1表達升高（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組及TCM組NLRP3、Caspase-1表達降低（P＜0.01）。
　　4.SABC法檢測UUO大鼠腎臟N

15、LRP3、Caspase-1分子蛋白表達：Sham組NLRP3表達不明顯，UUO組表達顯著增強，主要表達于腎間質巨噬細胞及腎小管上皮細胞，EPL組及TCM組表達較UUO組顯著減弱。Sham組Caspase-1呈弱表達，UUO組表達明顯增強，主要見于腎小管上皮細胞胞漿，EPL組及TCM組較UUO組顯著減弱。
　　5.Western blot檢測UUO大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1分子蛋白表達：Sham組NLRP3、Caspa

16、se-1分子均呈弱表達，UUO組表達明顯增強（P＜0.01），EPL組及TCM組表達較UUO組明顯減弱（P＜0.01）。
　　6.各組大鼠腎臟IL-1β分子mRNA及蛋白表達：見第一部分。
　　7.各組大鼠腎臟NF-κB mRNA及蛋白表達：與Sham組比較，UUO組腎臟NF-κB mRNA表達升高（P＜0.01）。與UUO組比較，EPL組及TCM組NF-κB mRNA表達降低（P＜0.01）。Western blot結果顯

17、示，Sham組大鼠腎臟NF-κB（p65）呈弱表達，UUO組表達明顯增強（P＜0.01）， EPL組及TCM組表達較UUO組明顯減弱（P＜0.01）。
　　第三部分：化瘀解毒中藥含藥血清對 mDCT細胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎癥小體信號通路的影響
　　目的：觀察醛固酮誘導的mDCT細胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB的表達情況，同時觀察mDCT細胞DNA損傷及膜損傷情況；以探索化瘀解毒

18、中藥對 mDCT細胞 NF-κB-NLRP3-Caspase-1-IL-1β信號轉導通路及細胞焦亡的影響；從而進一步明確化瘀解毒中藥拮抗炎性損傷的分子機制及其作用靶點。
　　方法：
　　1.含藥血清制備：10只SD大鼠以隨機數(shù)字表法隨機分為對照組與中藥組，每組5只。中藥組給予化瘀解毒中藥煎劑13.7g/（kg? d）；對照組給予等容量生理鹽水。每天1次，連續(xù)10天。末次給藥1h后腹主動脈采血，分離血清。
　　2.細胞培

19、養(yǎng)：腎小管上皮細胞mDCT培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液（含10％～20%胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100單位/ml）中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液，待細胞進入對數(shù)生長期后，制成單細胞懸液（4×104個/ml），接種于6孔板培養(yǎng)或分瓶培養(yǎng)24小時，換成無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時，使細胞同步化，而后加藥刺激24小時，收集細胞或上清液。
　　3.細胞分組：培養(yǎng)細胞分為五組：對照（Cont）組、醛固酮（ALD）

20、組、依普利酮加醛固酮（EPL+ALD）組、正常血清加醛固酮（NS+ALD）組和含藥血清加醛固酮（DS+ALD）組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液；其他各組均加入含1μM（終濃度）醛固酮的培養(yǎng)液；EPL+ALD組加入10μM（終濃度）的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液；NS+ALD組加入10%（終濃度）正常血清；DS+ALD組加入10%（終濃度）含藥血清。Western blot實驗細胞分為四組：對照（Cont）組、醛固酮（ALD）組、

21、依普利酮（EPL）組、中藥（TCM）組。Cont組加入無藥培養(yǎng)液；其他各組均加入含1μM（終濃度）醛固酮的培養(yǎng)液；EPL組加入10μM（終濃度）的依普利酮作用30分鐘后再加入醛固酮培養(yǎng)液；TCM組加入10%（終濃度）含藥血清；Cont、ALD及EPL組均加入10%（終濃度）正常血清。
　　4.檢測指標與方法：采用免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測醛固酮誘導的mDCT細胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達情況；乳酸脫

22、氫酶（LDH）實驗檢測mDCT細胞的膜損傷情況；TUNEL染色檢測mDCT細胞的DNA損傷情況；Western blot檢測mDCT細胞NLRP3、Caspase1、IL-1β及NF-κB（p65）的表達。
　　5.統(tǒng)計學處理同第一部分。
　　結果：
　　1.免疫熒光染色/激光共聚焦顯微系統(tǒng)檢測 mDCT細胞 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達：DAPI使mDCT細胞細胞核呈藍色熒光，NLRP3、Casp

23、ase-1及 IL-1β分子主要表達于細胞漿，呈橘紅熒光。結果證實經醛固酮刺激后，細胞可見NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達。
　　2.各組mDCT細胞培養(yǎng)上清液LDH含量比較：ALD組mDCT細胞培養(yǎng)上清液中LDH含量明顯高于Cont組（P＜0.01）；與ALD組比較，EPL+ALD組LDH含量明顯降低（P＜0.01）；DS+ALD組LDH含量低于NS+ALD組，但無統(tǒng)計學意義。
　　3.各組 mDCT細胞

24、TUNEL染色陽性率比較：ALD組 mDCT細胞TUNEL陽性細胞增多，高于Cont組（P＜0.01）；與ALD組比較，EPL+ALD組TUNEL陽性率降低（P＜0.05）；與NS+ALD組比較，DS+ALD組TUNEL陽性率降低（P＜0.05）。
　　4.各組mDCT細胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達：與Cont組比較，ALD組細胞NLRP3、Caspase-1及 IL-1β表達明顯增強（P＜0.01）；與AL

25、D組比較，EPL組及TCM組表達明顯減弱（P＜0.01）。
　　5.各組mDCT細胞NF-κB（p65）表達：Cont組細胞NF-κB分子均呈弱表達，ALD組表達明顯增強（P＜0.01），EPL組及 TCM組表達較ALD組減弱（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.炎性損傷在梗阻性腎病進展中發(fā)揮著重要作用，IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1等炎性因子參與這一過程。
　　2.細胞焦亡（Pyroptosi

26、s）是梗阻性腎病的重要病理改變，與NLRP3活化相關，通過NLRP3-Caspase-1-IL-1β/Pyroptosis通路誘導細胞損傷。
　　3.化瘀解毒中藥減輕梗阻性腎病炎性損傷的機制與其下調 NLRP3表達而抑制炎性因子分泌、并抑制Caspase-1介導的細胞焦亡相關。
　　4.炎性細胞浸潤、炎性因子增多分別是腎病“濁毒”形成的細胞學基礎、分子基礎之一；NF-κB-NLRP3-Caspase-1信號轉導通路是腎病“濁