三維灌注系統(tǒng)富集人腦膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)方法的探索.pdf

1、背景與目的：自2003年加拿大學者singh首先從人腦膠質(zhì)瘤手術標本中克隆、并鑒定了人腦膠質(zhì)瘤干細胞(GSC)以來，人們對GSC的認識在爭論中往前推進，經(jīng)過10多年的努力，對GSC功能的認識仍然不夠深入，特別是GSC在腫瘤細胞群中與其它分化細胞的關系不很明確，就GSC定義而言，它是少數(shù)具有自我更新能力并能夠產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞，并且隨著GSC數(shù)量的增加而惡性程度增高，預后變差。但就體外培養(yǎng)的GSC而言，數(shù)量的多少除了與培養(yǎng)基成份有關

2、，還與其生長的空間結構不無關系。本文旨在探索三維培養(yǎng)的GSC與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的GSC相比，能否達到富集GSC生長的目的。
　　材料與方法：人腦膠質(zhì)瘤干細胞GSC23由美國德克薩斯州大學M.D.Anderson腫瘤中心贈送。3D聚已內(nèi)酯支架（3D Cell Scaffold PCL）購于天津衛(wèi)凱生物工程有限公司。三維灌流培養(yǎng)系統(tǒng)Tissueflex?由英國Zyoxel公司提供。干細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。干細胞標志蛋白CD13

3、3購于英國Abcam公司。將GSC23（1×105）分別接種于普通平板、PCL支架和帶有PCL支架的三維灌流培養(yǎng)體系中。在三種不同培養(yǎng)條件下，分別進行熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況以及細胞形態(tài)空間結構變化，用Alamar Blue方法測定細胞生長曲線，用免疫細胞化學熒光染色方法檢測CD133+細胞的比例。用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果與分析：相比于普通平板培養(yǎng)條件，在PCL支架和灌流條件下細胞形態(tài)能維持在懸浮

4、培養(yǎng)條件時的成球狀態(tài)，且它們的增殖速度更快。普通平板組CD133+細胞比例低（17.56±2.39％），PCL支架組CD133+細胞比例高（33.50±6.62%），灌流組CD133+細胞比例更高（51.77±6.07%）。經(jīng)SPSS18.0軟件統(tǒng)計結果2D組和PCL支架組差異有統(tǒng)計學意義；PCL支架組和三維灌流培養(yǎng)組差異也有統(tǒng)計學意義。表明PCL支架創(chuàng)造的網(wǎng)格樣空間結構，讓定居在上面的GSC23細胞獲得了一個有利于擴增、類似于實體瘤的

5、三維空間，如果在這個空間環(huán)境里再有類似于血液，即流動著的干細胞培養(yǎng)液，滋養(yǎng)著GSC23細胞生長，則就能達到最大程度富集膠質(zhì)瘤干細胞的目的，三維灌流培養(yǎng)系統(tǒng)能做到這一點。
　　結論：用傳統(tǒng)方法在普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，分化細胞都貼壁生長（二維），唯有為數(shù)極少的漂浮在培養(yǎng)液中（三維）、折光性很強的小圓細胞，實際上其中不乏干細胞，說明只有三維空間才有利于干細胞生長；當提供的是三維的PCL支架而不是二維的普通培養(yǎng)皿時，能夠富集GSC23細胞生長