拉布拉多犬骨髓間充質干細胞與牙周膜基質干細胞細胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究.pdf

1、目的:通過體外加入骨向誘導液進行培養(yǎng)，觀察比較犬骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和牙周膜基質干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)的形態(tài)特征及兩者在體外成骨能力的差異；再分別與支架材料β-磷酸三鈣(β-TCP)復合并植入裸鼠皮下后，探索拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs異位成骨能力的差異。
　　方法:（1）犬BMSCs

2、的培養(yǎng)：成年拉布拉多犬一只，將犬髂后上棘去毛后消毒，鋪巾，待麻醉起效后，用骨髓穿刺針于犬髂后上棘穿刺抽取骨髓于離心管中，低速離心后將其接種于培養(yǎng)皿中，加入DMEM。待細胞培養(yǎng)至第3代后，取生長狀態(tài)良好者，加入成骨向分化誘導液進行體外誘導培養(yǎng)；（2）犬PDLSCs的培養(yǎng)取成年拉布拉多犬一只，消毒鋪巾麻醉起效后，拔取左下頜三顆下前牙，用PBS緩沖液從根尖向牙冠方向反復沖洗多次，用銳利手術刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，剪碎后接種于培養(yǎng)皿

3、中，添加適量DMEM，待細胞培養(yǎng)至第3代后，取生長狀態(tài)良好者，加入成骨向分化誘導液進行體外誘導培養(yǎng)。（3）檢測方法：MTT法檢測兩種基質干細胞的增殖差異；骨向誘導后1d、4d、7d、14d及21d，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法和茜素紅（ARS）染色法法檢測兩者成骨分化情況；骨向誘導后1d、4d、7d、14d及21d，RT-PCR檢測成骨誘導后成骨相關基因表達情況。取誘導培養(yǎng)7d后的第三代拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬 PDLSCs

4、，分別與2mm×Φ6mmβ-TCP復合。實驗分為3組，即β-TCP組,犬BMSCs/β-TCP復合體組,犬 PDLSCs/β-TCP復合體組。將細胞體外與材料復合后，常規(guī)培養(yǎng)3d，利用掃描電鏡觀察細胞與材料的黏附情況。并將各組復合物植入裸鼠皮下，裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)8周后取材，通過HE染色觀察新骨形成情況，免疫組化檢測成骨相關基因蛋白的表達。
　　結果:（1） BMSCs原代培養(yǎng)7d后，在顯微鏡下觀察可見有細胞爬出，并大量增殖，細胞呈長梭

5、狀；（2）PDLSCs原代培養(yǎng)7d后，顯微鏡下觀察可見有大量細胞從牙周膜組織塊中爬出，成放射狀分布，細胞呈長梭狀。兩者在細胞形態(tài)上無明顯差異；（3）MTT檢測顯示兩者均有良好的體外增殖能力，其中BMSCs的增殖能力稍強；（4）ALP和ARS的染色結果顯示兩者隨誘導時間的增加均有陽性顯色，且陽性染色結果漸強，同一時間點BMSCs的染色比PDLSCs的深；（5）RT-PCR結果顯示，在成骨誘導的過程中，成骨誘導相關基因BMP2、OCN、 R

6、UNX2、HIF-1α、VEGF、CLOOAGEN-1等都有明顯的表達，與PDLSCs組相比，BMSC組BMP2基因在骨誘導1d表達顯著高于PDLSCs組（P<0.01）但在骨誘導的7d和14d PDLSCs組BMP2基因表達要高于BMSC組（P<0.01）。BMSCs組 OCN基因，基因在骨誘導14d時表達明顯強于PDLSCs組（P<0.01）。RUNX2兩組中都有高表達但是結果顯示無統(tǒng)計學差異。BMSCs組HIF-1α，基因在骨誘導

7、4d時表達明顯低于PDLSCs組（P<0.01）。COLLAGEN-1 BMSCs組基因在骨誘導1d、4d、7d及14d時表達明顯高于PDLSCs組（P<0.01）。
　　掃描電鏡結果表明犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生長。兩種細胞均以較高的細胞密度生長于β-TCP表面及孔隙中，與骨架材料結合較好。裸鼠皮下組織切片HE染色結果顯示，犬BMSCs和犬PDLSCs組都有新生骨樣組織形成，免疫組織化學結果顯示