炎性刺激因子對大鼠骨髓間充質干細胞增殖及NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達的影響.pdf

1、目的：觀察炎性刺激因子脂多糖（LPS）、4-(甲基亞硝氨基)-l-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）及LPS聯(lián)合NNK對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響，探討長時間的炎性刺激對大鼠骨髓間充質干細胞NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達的影響，以及長時間炎性刺激對骨髓間充質干細胞向肝樣細胞定向分化的影響。
　　方法：（1）本實驗中所用到的骨髓間充質干細胞（BMSC）來源于SD大鼠，應用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)

2、純化大鼠骨髓間充質干細胞,使用含10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，首次換液時間為取材24小時后，之后每隔3天換一次培養(yǎng)液，當培養(yǎng)瓶中細胞融合率達到70%至80%時，使用膠原蛋白酶消化，1:2傳代至新的培養(yǎng)瓶中，取第三代大鼠骨髓間充質干細胞用于實驗。（2）應用MTT法檢測炎性因子對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響，以選擇最佳的孵育濃度，分為對照組、LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組。（3）應用免疫細胞化學實驗檢測大鼠骨髓間充質

3、干細胞NF-κB、CUGBP1蛋白表達的位置的變化。（4）Western blot檢測大鼠骨髓間充質干細胞NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達量的變化。（5）應用肝組織液誘導劑誘導大鼠骨髓間充質干細胞20天，靛青綠實驗檢測干細胞向肝樣細胞分化情況。
　　結果：（1）MTT實驗結果顯示，不同組的炎性因子都能促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，其中以LPS12.5μg/ml、NNK10μg/ml、LPS12.5μg/ml聯(lián)合NNK

4、10μg/ml組對大鼠BMSCs增殖的促進效果最明顯。（2）免疫細胞化學實驗結果可見，炎性刺激后細胞內(nèi)NF-κB、CUGBP1蛋白的表達量和位置不同，LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組的NF-κB表達量均增加，細胞核和細胞質中均有表達，主要在細胞核中表達。炎性因子長時間刺激后，表達量明顯增加。NNK組、LPS聯(lián)合NNK組CUGBP1蛋白的表達量明顯增加，孵育1天后主要在細胞質中表達，隨著孵育時間的延長CUGBP1蛋白轉移至細胞核中，

5、并且表達量明顯增加。（3）Western blot定量分析可見炎性刺激后LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組 NF-κB、p-P38蛋白表達量增加，LPS和NNK聯(lián)合組高于LPS組和NNK組。炎性刺激后，LPS聯(lián)合NNK組CUGBP1蛋白表達量比LPS組和NNK組明顯增加。并且，隨著孵育時間的延長，NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達增加更為明顯（4）靛青綠實驗顯示，炎性刺激后，干細胞向肝樣細胞的分化明顯減少，LPS聯(lián)合NNK

6、組的靛青綠攝取量明顯少于LPS組和NNK組。
　　結論：(1)炎性因子可能通過激活P38MAPK和NF-κB信號途徑促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖。長時間的炎性因子刺激，促進了NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白在細胞核中的表達。(2)長時間的炎性因子刺激后，炎性刺激組NF-κB、p-P38蛋白的表達量明顯增加NNK組、LPS聯(lián)合NNK組NF-κB、p-P38、CUGBP1的表達量明顯增加，并且聯(lián)合組明顯高于NNK組，揭示了L