擬南芥AT14A蛋白的細胞學定位及在介導細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體中的功能研究.pdf

1、植物細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體的研究目前還處于起步階段，特別是質膜上的聯結分子特性與功能還未形成定論。在動物細胞質膜上存在一類整合素蛋白(integrin)，它是一類胞外基質受體，介導細胞間的粘附作用和細胞內外的信號轉導，并且參與調節(jié)多種細胞功能，如細胞分化、細胞與細胞間的相互作用、細胞對外界環(huán)境應答等。在植物細胞中是否也存在類似于動物細胞中的整合素蛋白分子目前尚無直接的實驗證據。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段與動物整合素蛋白同源，

2、然而，目前還不清楚該蛋白是否就是植物細胞中的整合素蛋白(稱為類整合素，integrin-like proteins)?如是，其功能又是如何?針對上述科學問題，本研究首先從擬南芥基因組中克隆了編碼AT14A的基因序列，構建了相應突變體和過表達轉基因懸浮培養(yǎng)細胞系，最后研究了該蛋白在介導細胞壁-質膜-細胞骨架連續(xù)體中的功能。取得的主要結果如下： 1、采用RT-PCR和TOPO克隆的方法從擬南芥中克隆出了AT14A，并與含GFP報告基

3、因的表達載體連接，得到AT14A-GFP融合基因，通過農桿菌介導的方法轉化野生型植株及懸浮細胞，獲得了相應的轉基因植株和懸浮細胞體系。通過觀察GFP的熒光，確定AT14A在組織和細胞水平的定位。同時，完整植物材料體系的建立為研究AT14A的功能奠定了基礎。 2、利用蛋白質免疫印跡技術，以GFP抗體作為探針，在過表達轉AT14A-GFP融合基因的懸浮細胞總蛋白與膜蛋白中均檢測到了AT14A-GFP融合蛋白的存在，其分子量在70 k

4、Da左右。且通過免疫印跡方法，在膜蛋白中也檢測到了AT14A-GFP融合蛋白的存在，證實AT14A定位在質膜上。 3、通過光學顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，發(fā)現缺失型突變體at14a懸浮細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，即60％以上變成球形。利用熒光定位技術，結合激光共聚焦顯微鏡的觀察，發(fā)現野生型、缺失型突變體at14a、過表達轉AT14A-GFP融合基因懸浮細胞的細胞骨架的結構與排列存在差異：缺失型突變體at14a懸浮細胞的微絲束變粗，且排列變

5、得稀疏，而過表達轉AT14A-GFP融合基因的懸浮細胞的微絲排列較野生型密集；缺失型突變體at14a細胞的微管排列雜亂而無規(guī)則，但過表達轉AT14A-GFP融合基因細胞的微管形態(tài)與排列與野生型無明顯區(qū)別。 4、對懸浮細胞的細胞團大小的觀察及統(tǒng)計的結果表明，野生型懸浮細胞57％的細胞團包含2-10個細胞，40％的細胞團包含10個以上細胞；缺失型突變體at14a懸浮細胞42％以單個游離的形式存在，且低于10％的細胞團包含10個以上細

6、胞；而過表達轉AT14A-GFP融合基因懸浮細胞的細胞團有74％包含10個以上細胞。此結果說明，AT14A參與了細胞與細胞之間的粘附。對三種基因型的懸浮細胞進行滲透脅迫處理的結果表明野生型細胞有90％以上發(fā)生部分質壁分離，約6％發(fā)生完全分離；而缺失型突變體at14a細胞均發(fā)生了質壁分離，并且其中62％發(fā)生了完全質壁分離；過表達轉AT14A-GFP融合基因懸浮細胞的分離情況與野生型無明顯差異。通過測定三種基因型植株離體葉片失水速率的測定結

7、果表明缺失型突變體at14a離體葉片的失水速率最大，野生型次之，過表達植株的離體葉片的失水速率最小。以上結果提示：AT14A作為細胞壁(CW)-質膜(PM)-細胞骨架(CTK)連續(xù)體的重要聯結分子，由于AT14A的缺失，導致細胞壁與質膜的粘附性降低，所以，在同樣的脅迫條件下，缺失型突變體at14a懸浮細胞完全質壁分離的情況最為明顯。并且，AT14A參與了細胞對滲透脅迫的響應過程，缺失型突變體由于AT14A功能的缺失，因而失去了對于滲透脅