CD90陽性細胞篩選及PI3K-AKT信號通路對其干細胞樣特性影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，廣西地區(qū)發(fā)病率更是高居中國的首位。近年來，基于腫瘤干細胞理論提出腫瘤治療新型理念并廣泛的在多種實質細胞和動物的體內展開實驗研究。越來越多的證據(jù)支持腫瘤異質性的存在，而腫瘤干細胞為其根源。腫瘤干細胞來源于腫瘤細胞內一群數(shù)量極少量生長極度旺盛，有著強大的自我更新、無限增殖化分化、潛能、高度致成瘤性的細胞。此類細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程以及腫瘤治療后的復發(fā)、對放化療的耐藥等方面，都起到了極

2、為重要的作用。而在腫瘤細胞中其他的多數(shù)細胞不具備無限增殖潛能，幾乎遵循的是短暫的分化成熟以后，最終發(fā)展為死亡的過程。我們認為肝癌細胞中也存在著這樣一群肝癌干細胞，通過無血清懸浮成球培養(yǎng)，流式細胞技術能夠篩選出肝癌干細胞，并進一步探討PI3K/AKT信號通路對肝癌細胞系MHCC97L中CD90（Thy-1）陽性亞群細胞比例及干細胞特性的影響。
　　方法:
　　1.采用完全培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基加入相關生長因子培養(yǎng)肝癌細胞系MHC

3、C97L，分別進行貼壁和懸浮成球培養(yǎng)，收集相應細胞進行后續(xù)實驗。
　　2.糖原染色方法檢測細胞球來源。
　　3.流式細胞技術（flow cytometry）檢測MHCC97L細胞系中貼壁細胞和懸浮成球細胞流式抗體CD90的表達量。
　　4.貼壁培養(yǎng)和懸浮成球培養(yǎng)細胞分別經PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后，流式細胞技術檢測CD90表達量的變化。
　　5. MTT法檢測LY294002分別處理CD

4、90+亞群細胞和CD90-亞群細胞前后，兩組細胞的增殖率變化。
　　6. qRT-PCR檢測LY294002分別處理CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞前后，其肝癌干細胞相關基因CD90，SHP2的表達量的變化
　　7. Western blot檢測CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞經LY294002處理前后肝癌干細胞相關蛋白以及PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達情況。
　　8.平板克隆實驗檢測LY29400

5、2對CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞克隆形成能力的影響。
　　9.比較不同濃度梯度的CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞裸鼠皮下成瘤能力，以及LY294002處理后成瘤能力的變化情況。
　　10.免疫組織化學法檢測CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞所形成的裸鼠皮下瘤中肝癌干細胞相關蛋白和PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達量；以及經LY294002處理后相應蛋白表達量變化情況。
　　結果：
　　1.肝

6、癌細胞系MHCC97L細胞在完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)約5天可以穩(wěn)定傳代；在無血清培養(yǎng)基懸浮成球培養(yǎng)約7-9天可以穩(wěn)定傳代。
　　2.糖原染色可說明細胞球來源于肝癌細胞。
　　3.流式細胞儀檢測結果表明肝癌干細胞標志物CD90在成球培養(yǎng)細胞中的表達量高于在貼壁培養(yǎng)細胞中的表達量（P<0.01）。
　　4.經PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后，流式細胞技術檢測CD90+亞群細胞CD90表達量下降較CD90-亞

7、群細胞明顯（P<0.05）。
　　5. CD90+亞群和CD90-亞群的細胞中，MTT法檢測CD90+亞群細胞增值率變化較CD90-亞群細胞明顯。
　　6.加入LY294002抑制劑后，qRT-PCR檢測CD90+亞群細胞中肝癌干細胞相關基因CD90、SHP2的表達量較未加入LY294002前表達量明顯下降（P<0.05）；CD90-亞群細胞表達量變化不明顯。
　　7.加入LY294002抑制劑后，Western bl

8、ot檢測CD90+亞群細胞中的肝癌干細胞相關蛋白CD90、SHP2的表達量下降明顯（P<0.05）。PI3K/AKT信號通路的下游特異性蛋白P-AKT的表達量下降（P<0.05）；AKT蛋白表達量無明顯變化。
　　8. CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞克隆形成率分別為（93.13±4.72）％、（20.59±3.23）%，CD90+亞群細胞克隆形成率明顯高于CD90-亞群細胞。CD90+亞群細胞和CD90-亞群細胞加入LY2

9、94002后，克隆形成率分別為（51.32±6.27）%、（18.37±3.21），CD90+亞群細胞克隆形成率顯著降低（P<0.05），而加入LY294002對CD90-亞群細胞克隆形成率無明顯影響（P>0.05）。
　　9.相同細胞個數(shù)下，CD90+亞群細胞裸鼠皮下成瘤能力明顯高于CD90-亞群細胞成瘤能力。
　　10. CD90蛋白和SHP2蛋白在CD90+亞群細胞未加藥時表達明顯強于CD90+亞群細胞加抑制劑LY29

10、4002后的表達量；CD90-亞群細胞未加藥的表達量與加藥后變化不大。經LY294002處理后，CD90+亞群細胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、P-AKT蛋白表達量均較對照組明顯減少，AKT蛋白表達量無明顯變化；CD90-亞群細胞所形成的裸鼠移植瘤中CD90、SHP2、P-AKT、AKT蛋白表達量無明顯變化。
　　結論:
　　無血清的條件培養(yǎng)基能較好的富集有肝癌干細胞特性的細胞亞群，流式分選MHCC97L細胞系所獲