甲基對硫磷降解菌的篩選及其甲基對硫磷水解酶基因的克隆.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、有機磷農(nóng)藥作為一類高效廣譜的殺蟲劑自從上世紀40年代發(fā)明以來,已在全世界范圍內(nèi)大面積使用。在半個多世紀里,這類殺蟲劑增加了農(nóng)作物的產(chǎn)量,為人類社會的發(fā)展做出了重要的貢獻。但是隨著有機磷農(nóng)藥的長期和大范圍使用,越來越多的環(huán)境問題,人類健康問題,人類可持續(xù)發(fā)展問題開始凸顯出來。有機磷降解酶可以破壞有機磷農(nóng)藥分子的磷脂鍵,最終使其脫毒。因此,通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)高效、廉價具有廣譜特性的有機磷降解酶制劑是目前消除有機磷農(nóng)藥污染的最有潛力的方法。

2、 本研究從農(nóng)藥廠被農(nóng)藥長期高度污染的土壤中通過富集培養(yǎng)分離得到一株能夠降解甲基對硫磷農(nóng)藥的細菌M231,經(jīng)過16SrDNA方法鑒定為蒼白桿菌(Ochrobactrum),此菌能組成型分泌甲基對硫磷水解酶MPHXW。 通過保守區(qū)設(shè)計簡并引物,PCR擴增得到該甲基對硫磷水解酶基因的部分片段。通過將已知序列在網(wǎng)上進行比對,進而設(shè)計特異引物克隆得到甲基對硫磷水解酶基因mphxw全長。編碼基因全長993bp,(G+C)含量為67.

3、27%,具有一個開放讀碼框,編碼330個氨基酸,其中前35個氨基酸殘基為信號肽序列,蛋白質(zhì)理論分子量為35kD。編碼基因的核苷酸序列分析表明,雖然該基因與目前發(fā)表的來源于蒼白桿菌Ochrobactrum的甲基對硫磷水解酶蛋白相似性達到98%,但比它們少一個氨基酸。同時該基因與本實驗室先前報道的OPHC2相似性非常低,只有43.7%。mphxw已經(jīng)在GenBank中登錄,登錄號是EU596456。 將不帶有信號肽的編碼序列分別構(gòu)建

4、了原核表達重組載體pET-mphxw和真核表達重組載體pPIC9γ-mphxw,原核表達產(chǎn)物具有正常生物學(xué)功能。同時也篩選到了一批能夠分泌表達甲基對硫磷水解酶真核重組子。 從原菌Ochrobactrumsp.M231和原核表達重組子中純化了該基因的原菌蛋白和原核重組蛋白,對純化的原菌蛋白進行了質(zhì)譜分析表明,分離純化的原菌蛋白和從該菌中克隆得到基因表達蛋白的序列是一致的。對原菌蛋白和原核重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進行了測定,發(fā)現(xiàn)在最適反應(yīng)

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