高糖對腎小球系膜細胞生物鐘基因表達的影響及機制探討.pdf

1、目的:晝夜節(jié)律(Circadian rhythm)是自然界最普遍的自然現(xiàn)象之一，晝夜節(jié)律生物鐘(Circadian clock)就是設定并調控機體出現(xiàn)這種晝夜節(jié)律的系統(tǒng)，是一種以近似24小時為周期的晝夜節(jié)律振蕩器(Circadian oscillator)。生物鐘與太陽光周期變化、物質代謝和能量攝取同步。血糖作為物質代謝和能量攝取的重要環(huán)節(jié)及組成部分，大量動物實驗及臨床研究證實生物鐘基因表達水平高低與血糖水平密切相關，生物鐘基因的缺失可

2、導致胰島素分泌減少、胰島素分泌節(jié)律紊亂，生物鐘節(jié)律紊亂成為糖尿病發(fā)病的重要危險因素。但目前尚無研究系統(tǒng)探討高糖對生物鐘基因的影響及生物鐘基因在糖尿病并發(fā)癥發(fā)病中的作用及機制，故本研究通過觀察小鼠腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell，GMC)生物鐘基因在不同濃度高糖及在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acctyl-L-cystcinc，NAC)干預下

3、的表達變化，同時檢測小鼠腎小球系膜細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子表達變化，旨在探討高糖對腎小球系膜8個生物鐘基因表達的影響及作用機制。
　　方法:1.細胞培養(yǎng)及實驗分組:體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞，以不同濃度高糖作為刺激因素，活性氧抑制劑NAC作為ROS阻斷劑干預高糖作用，分別設為以下4組:(1)正常對照組（normal control group，NC組）:培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖;(2)滲透壓對照組(osmotic pres

4、sure group， OP組）:培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇（滲透壓約等于30mmol/L高糖組）;(3)不同濃度高糖組（high glucose group，HG組）:培養(yǎng)基分別含10mmol/L葡萄糖(HG1組)、20mmol/L葡萄糖（HG2組）、30mmol/L葡萄糖（HG3組）;(4) NAC+高糖組(NAC+HG組):表達變化最強濃度的高糖組預先加入10μmol/L活性氧抑制劑NAC工作液作

5、為干預因素，了解活性氧在高糖誘導的腎小球系膜細胞生物鐘基因改變中的作用。2.檢測方法:(1)各組小鼠腎小球系膜細胞適時隨機分別加入不同作用物培養(yǎng)24小時后用RT-PCR法檢測細胞中8個生物鐘基因CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Per2，Per3，Cry1，Cry2 mRNA表達水平變化;(2)各組小鼠腎小球系膜細胞適時隨機分別加入作用物培養(yǎng)24小時后裝載2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2'，7'-Dichloro

6、fluorescin Diacetate，DCFH-DA)，用分光光度計檢測細胞內ROS水平變化;(3)各組小鼠腎小球系膜細胞適時隨機分別加入作用物培養(yǎng)24小時后收集細胞培養(yǎng)液，離心后取上清液用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子白介素-6(Interleukin-6，IL-6)及C-C趨化因子配體-2(C-Cchemokine ligand2，CCL-2;又稱為單核細胞趨化蛋白-1，monocytechemotactic prot

7、ein1，MCP-1）的表達變化。3.統(tǒng)計學分析:應用統(tǒng)計軟件SPSS20.0進行數據分析，數據用均數±標準差（(x)±s）表示，組內比較采用方差齊性檢驗，各組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，我們定義P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.與正常對照組相比，高糖組小鼠腎小球系膜細胞生物鐘基因 CLOCK, BMAL1, REV-ERBα, Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 m

8、RNA表達水平均增加(P＜0.05)，其中CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Per2，Per3，Cry2 mRNA表達增加呈濃度依賴性;同時，與正常對照組相比，高糖組小鼠腎小球系膜細胞內ROS水平及細胞培養(yǎng)上清液中IL-6及CCL-2表達水平均呈濃度依賴性增加(P＜0.05)。2.與高糖組相比，預先加入NAC干預高糖氧化應激作用后可阻止高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞CLOCK，BMAL1，REV-ERBα，Per1，Pe