大田軟海綿酸多克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立.pdf

1、腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning,DSP)是一類由有毒甲藻產(chǎn)生的脂溶性多環(huán)醚類赤潮毒素,主要成分是大田軟海綿酸(Okadaic Acid,OA)及其衍生物。DSP可通過食物鏈蓄積到濾食性水產(chǎn)動物體內(nèi),引起消費(fèi)者食物中毒。DSP因其世界性分布、高頻率爆發(fā)性及潛在危害性而成為研究熱點(diǎn),各國以高準(zhǔn)確性、高精密度、低檢出限及操作便捷為目標(biāo),紛紛建立并完善其檢測方法,而我國對此研究尚處于起步,技術(shù)相對落

2、后,因此,建立DSP快速檢測方法,已成為保障水產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展及消費(fèi)者人身安全的重要研究內(nèi)容之一。本研究將DSP中主要的致病因子-大田軟海綿酸(OA)作為研究對象,開展對OA的免疫學(xué)快速檢測方法的研究,為建立快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法提供了可靠的方法基礎(chǔ)。
　　 OA完全抗原的制備
　　 利用OA分子中的羧基與蛋白分子中的氨基,采用活潑酯法將OA與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)進(jìn)行偶聯(lián),制備了相應(yīng)的完全免疫抗原

3、OA-KLH及包被抗原OA-OVA,用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法和紅外光譜法對人工抗原的偶聯(lián)效果進(jìn)行分析,結(jié)果表明OA已偶聯(lián)到載體蛋白分子上,OA的免疫抗原及檢測抗原制備成功。
　　 OA多克隆抗體的獲得及純化
　　 用人工抗原OA-KLH對新西蘭白兔進(jìn)行劑量階梯遞進(jìn)式免疫,即每次加強(qiáng)免疫時(shí)適當(dāng)加大免疫原用量,采用間接ELISA方法測定血清滴度及親和力的變化。六次免疫后一周取全血,抗血清經(jīng)飽和硫酸銨和Protein A凝膠

4、層析柱兩步純化處理后獲得純化的多克隆抗體,并用紫外全波長掃描及間接競爭ELISA法驗(yàn)證其純化效果。結(jié)果獲得滴度為12800、親和力高的抗OA血清。抗血清經(jīng)純化處理后,紫外光譜掃描表明大量干擾物質(zhì)純化效果較好,間接競爭ELISA檢測顯示經(jīng)純化處理后抗體親和力提高。
　　 OA間接競爭ELISA(ciELISA)檢測方法的建立
　　 建立并優(yōu)化了大田軟海綿酸的ciELISA檢測條件:確定了包被抗原及抗體最佳工作濃度分別為1m

5、g／L,純化抗體稀釋倍數(shù)為300倍,最佳包被液為0.05 mol／L pH9.6的CBS緩沖鹽溶液,包被條件為4℃孵育過夜,競爭時(shí)間為1 h,辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔的最佳使用濃度為稀釋5000倍。由篩選得到的優(yōu)化條件組合得到,大田軟海綿酸在0.977～250 ng／mL濃度范圍內(nèi),抑制率與濃度對數(shù)值呈線性關(guān)系,回歸方程為y=13.886Ln(x)+11.744,R2=0.9871,IC15=(1.26±0.32)ng／mL,與鰭藻毒素1

6、(DTX-1)的交叉反應(yīng)率為46.94％。
　　 樣品基質(zhì)影響的消除
　　 在樣品基質(zhì)影響消除試驗(yàn)中,采用直接稀釋法和吹干復(fù)溶法進(jìn)行消除。直接稀釋法是在貝樣中將按(1:1,w:v)加入80％甲醇,提取液經(jīng)PBS緩沖鹽溶液40倍稀釋后直接檢測,回收率為72.67％～118.23％,與高效液相色譜熒光檢測法(HPLC-FLD)檢測結(jié)果有良好的相關(guān)性,y=1.0064x-10.234,R2=0.9347,但此方法對低OA含量的