高通量結核分枝桿菌蛋白可溶表達篩選平臺的構建與應用.pdf

1、結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌，近年來隨著結核耐藥及結核與HIV共感染的問題越來越嚴重，結核病有死灰復燃的趨勢。對結核分枝桿菌的研究是解決結核病難題的關鍵之一，結核分枝桿菌的致病機理研究和關鍵藥物靶點的結構與功能研究都需要重組表達信號通路中的關鍵蛋白或者藥物靶標蛋白。
　　然而結核分枝桿菌蛋白質的結構與功能研究由于受結核分枝桿菌蛋白難以可溶表達和純化的影響而進展緩慢。融合標簽技術是近年來興起的一項重組DNA技術，在重組蛋白的純化

2、、促進重組蛋白的表達、幫助重組蛋白正確折疊、提高重組蛋白的可溶性及穩(wěn)定性等方面有很大的應用價值。
　　為找到能更好的表達結核分枝桿菌蛋白的重組表達系統(tǒng)，解決結核分枝桿菌蛋白可溶表達的難題，將多個能促進可溶表達的蛋白標簽與高通量的Gateway克隆技術相結合，構建了結核分枝桿菌蛋白可溶表達快速通量的篩選平臺。在保證蛋白分子量大小平均分布的前提下隨機挑選46個已知以包涵體形式表達或者不表達的結核分枝桿菌蛋白的基因，分別克隆到帶有N-末

3、端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白標簽基因的載體上，酶切驗證成功后轉化Rosetta(DE3)表達菌株。重組蛋白表達載體在Rosetta表達菌株中經IPTG誘導表達;采用Tricine-SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況，統(tǒng)計結核桿菌重組蛋白表達情況，比較5種蛋白融合標簽的促溶效果。
　　統(tǒng)計結果表明，Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標簽均可促進結核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中

4、可溶表達，其中Nus.A融合標簽促溶效果明顯優(yōu)于其他4種蛋白融合標簽;當融合Nus.A標簽蛋白基因后，可顯著促進結核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中可溶表達。融合Nus.A標簽后，可溶表達的蛋白數量占總樣品數的比例提高到41％，與未融合標簽的菌株相比提高了32％;同時其他的標簽SUMO、MBP、Trx.a、ACP融合蛋白可溶表達數量占總樣本數的比例分別提高到21％、26％、26％、21％，雖然可溶蛋白比例沒有Nus.A融合蛋白高，但也均能不

5、同程度的促進結核分枝桿菌蛋白可溶表達。
　　本文成功構建帶有N-末端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標簽基因的原核表達載體，并且與高通量的Gateway克隆技術相結合，建立了結核分枝桿菌重組蛋白可溶表達的快速通量篩選平臺。本研究構建的載體引入了Gateway反應位點attR1-ccdB-attR2，克服了克隆位點不一致、重組蛋白性質不同等原因不能高通量表達、純化異源蛋白的困難;所有結核分枝桿菌蛋白基因均

6、可采用Gateway克隆技術高通量的重組到構建的所有載體中，所有克隆均可平行進行，且所需實驗時間很短，節(jié)省了大量的時間，實現結核分枝桿菌蛋白基因高效克隆;此外，除MBP融合蛋白外，其余融合蛋白的N端均帶有6個組氨酸標簽(6 His)，因此可以通過Ni-NTA親和層析進行純化，實現結核分枝桿菌重組蛋白高效表達篩選。再者，本研究經比較得出Nus.A蛋白融合標簽在促進結核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌可溶性表達中有較好作用，為結核分枝桿菌重組蛋白