當歸補血復合微囊經JAK2-STAT3信號傳導途徑促進組織創(chuàng)傷修復機制的研究.pdf

1、促進創(chuàng)面愈合是中醫(yī)外科臨床的主要目標之一，鼓舞氣血以生肌斂瘡是其指導思想。當歸補血湯又名黃芪當歸湯、補血湯、芪歸湯等，是金元時代李東垣所創(chuàng)造的益氣補血方劑，由黃芪、當歸組成，具有補氣生血的功能。充滿生機活力的血管網是氣血充盈的物質基礎之一，肉芽鮮活紅潤、斂瘡收口的局部辯證之所見，正是氣血旺盛病機的內涵，也是血管新生等生物學過程系統(tǒng)效應的體現(xiàn)。
　　現(xiàn)有研究表明，中藥制劑修復創(chuàng)面的生物學過程與現(xiàn)代創(chuàng)傷修復理論一致，創(chuàng)面組織的生長與存

2、活離不開血液供應，因此，血管新生是創(chuàng)傷修復過程中修復細胞及組織細胞賴以生存生長的重要基礎之一。在促血管新生的研究中，要求藥物作用時間能夠順應創(chuàng)傷修復的規(guī)律，達到良性干預的目的。
　　課題組通過制劑學的方法，將中藥復方當歸補血湯提取物，配合緩控釋高分子材料，優(yōu)化其配比及成囊工藝，控制其藥物釋放，達到零級動力學要求，制成控釋微囊，再載入修飾后可降解膠原原位誘導、促進血管新生。
　　本研究分別以細胞模型和整體動物模型為研究對象，以

3、本實驗平臺為技術支撐，從組織、細胞、調控蛋白再到關鍵基因，層層遞進深入，揭示當歸補血復合微囊促進創(chuàng)面愈合的JAK2/STAT3信號傳導通路及其相關關鍵蛋白和基因靶點，從一個側面闡述當歸補血復合微囊促愈的現(xiàn)代生物學物質基礎及其機制。
　　首先，本研究以人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC為模型，分別采用CCK-8和流式細胞術檢測HUVEC細胞活力和細胞凋亡情況;采用Western blot檢測各組中STAT3、VEGF的表達情況;采用熒光

4、定量PCR，檢測各組中VEGF基因和miRNA-21的表達情況。探討JAK2/STAT3信號傳導通路在當歸補血復合微囊促血管新生中的作用。結果顯示20μg/mL當歸補血復合微囊作用于HUVEC24h，可有效促進HUVEC的增殖。當歸補血復合微囊能促進HUVEC的增殖，并上調STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達，其促進血管生成的作用與JAK2/STAT3信號途徑有關。AG490能有效抑制當歸補血復合微囊對HUVE

5、C的促增殖作用，并減少STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達，進一步驗證說明當歸補血復合微囊促進血管生成的作用確實與JAK2/STAT3信號途徑有關。
　　其次，本研究采用雞胚絨毛尿囊膜CAM實驗，結果顯示，當歸補血復合微囊可有效促進雞胚絨毛尿囊膜血管新生，其中20-60μg/ml各劑量組的促血管新生作用顯著。
　　最后，本研究采用外科方法縱行切開背部皮膚建立了大鼠創(chuàng)傷模型，從整體動物層面中羥脯氨酸含

6、量、HE染色肉芽組織增生情況、CD34標記的微血管數(shù)量、masson染色膠原纖維生成情況，蛋白層面中STAT3蛋白磷酸化水平和VEGF水平，以及基因層面中VEGF mRNA和miRNA-21的表達等不同層次闡述了當歸補血復合微囊膠原在大鼠損傷模型中的修復作用。結果顯示，當歸補血復合微囊給藥后肉芽組織中羥脯氨酸含量增加，肉芽組織毛細血管及成纖維細胞增生活躍，創(chuàng)面微血管數(shù)量增加，膠原纖維生成密度均勻、排列有序。當歸補血復合微囊可激活p-ST

7、AT3和VEGF蛋白表達，上調VEGF mRNA和miRNA-21基因轉錄水平。當歸補血復合微囊可加快創(chuàng)面愈合，具有促進血管新生的作用。
　　綜上所述，當歸補血復合微囊促進創(chuàng)傷愈合的作用途徑之一可能是通過JAK2/STAT3信號通路完成，促進HUVEC的增殖，并上調STAT3、VEGF及VEGFmRNA，miRNA-21的表達，增加肉芽組織中羥脯氨酸含量，促進肉芽組織毛細血管和成纖維細胞增生，增加創(chuàng)面微血管數(shù)量和膠原纖維，最終實現(xiàn)