新型結核病疫苗免疫組分和診斷分子標識候選物的初步篩選及鑒定.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)一直是一個嚴重的全球公共健康問題，其死亡率居于單一細菌感染致死亡性疾病之首。傳統(tǒng)的結核病檢測方法有痰涂片，痰培養(yǎng)，PCR，ELISPOT，TST，胸片等，但是它們存在明顯的不足，比如有的耗時較長，有的假陽性率高，而且不能對結核分枝桿菌菌陰的病人進行正確診斷。因此需要尋找一種準確、快速、新的診斷方法，為后期臨床治療提供依據(jù)。現(xiàn)今細胞免疫檢測方法使用的抗原有ESAT-6，CFP10和TB7.7，血清學

2、檢測使用的抗原是38kDa(Rv0934)。目前臨床上使用的唯一預防性結核病疫苗-卡介苗對兒童結核性腦膜炎具有保護作用，但是對青少年和成人的肺結核保護力為0-80％，具有可變性。因此迫切需要研制新型有效的結核病疫苗。
　　本研究通過篩選結核分枝桿菌的分泌蛋白和膜蛋白，尋找潛在的新型結核病疫苗免疫組分和診斷分子標識候選抗原。
　　首先使用生物信息學軟件對結核分枝桿菌H37Rv菌株全蛋白質(zhì)組進行預測分析確定研究對象。然后將入組的

3、膜蛋白和分泌蛋白進行重組表達。對表達獲得的重組蛋白逐一進行Western Blot和ELISPOT篩選，根據(jù)第二輪細胞免疫篩選結果選取5個蛋白進行動物實驗，驗證5個蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)的免疫原性。最終結果如下:
　　經(jīng)生物信息學軟件對結核分枝桿菌H37Rv菌株的3989個開放閱讀框編碼的蛋白預測確定有240個開放閱讀框編碼的膜蛋白和242個開放閱讀框編碼的分泌蛋白入組。本研究利用Gateway系統(tǒng)和一步克隆法成功構建了46

4、7個表達克隆，通過兩輪表達得到219個膜蛋白、141個分泌蛋白。將所有純化得到的蛋白使用離子軌道肼質(zhì)譜驗證重組蛋白的蛋白序列是否正確，經(jīng)驗證360個蛋白序列全部正確，正確率100％。
　　經(jīng)過使用229個活動性肺結核病病人血清進行三輪蛋白質(zhì)免疫印跡實驗篩選得到18個膜蛋白、26個分泌蛋白反應強度與陽性對照Rv0934的峰面積比值大于1。每個蛋白使用3個活動性肺結核病人PBMC進行ELISPOT，初次篩選使用73個活動性肺結核病人P

5、BMC。經(jīng)過初步篩選得到8個膜蛋白、9個分泌蛋白平均反應強度達到陽性對照ESAT-6的50％以上。將Western Blot初步篩選得到的17個蛋白使用健康人和病人血漿進行復篩，得到5個蛋白反應在健康人和病人血漿中反應具有差異。
　　將ELISPOT初步篩選結果得到的17個蛋白使用15個ESAT-6陽性病人PBMC進行復篩，得到5個蛋白反應強度達到陽性對照ESAT-6的40％以上，可以作為目標候選抗原;6個ESAT-6陰性病人PB

6、MC進行復篩，3個蛋白可能與ESAT-6互為補充，與ESAT-6組合使用可能會提高活動性肺結核檢測的吻合率。
　　蛋白免疫小鼠實驗結果顯示S43蛋白能刺激小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ，CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2; S4蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ。M62，M15，M1蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2。M15，M1，S43，S4，S71作為抗原刺激脾細胞時，可以觀察到CD4+T、C

7、D8+T淋巴細胞的增殖現(xiàn)象，但是與PBS對照組相比沒有統(tǒng)計學意義。當M15，M1，S43，S4，S71作為抗原刺激脾細胞時，可以檢測到不同細胞因子不同程度的分泌。
　　本研究已經(jīng)獲得了10個候選蛋白的體液免疫和細胞免疫、及免疫原性的初步結果。這10個蛋白的應用價值需要進一步研究驗證。
　　綜上所述，我們首次對結核分枝桿菌H37Rv的膜蛋白和分泌蛋白進行系統(tǒng)研究，得到了一系列可以用作疫苗候選物或是診斷標識的蛋白。由于結核分枝桿