Atg161L1變異體與細胞自噬的關系.pdf

1、目的:探討自噬基因Atg16L1基因變異體與自噬功能的關系。
　　 方法:首先，采用生物信息學方法，以基因組DNA序列、cDNA序列和EST數(shù)據(jù)為依據(jù)，搜索Pfam數(shù)據(jù)庫、PSIPRED數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫等，對Atg16L1變異體進行結構分析并對其進行克隆。第二，采用激光共聚焦顯微鏡技術觀察Atg16L1變異體在細胞內自噬泡、溶酶體和線粒體上的定位情況。第三，采用細胞轉染技術，過表達Atg16L1變異體和GFP-LC3，分析L

2、C3的酯化變化，進一步探討Atg16L1變異體對細胞自噬的影響。
　　 結果:(1)人Atg16L1基因可編碼七種剪接變異體，其中野生型Atg16L1基因編碼607氨基酸，包含coiled-coil區(qū)域和七段WD repeats重復結構域。Swiss-PdbViewer4.0.4軟件對其變異體分析指出，Atg16L1剪接變異體的差異主要存在于coiled-coil區(qū)域中。本文已獲得Atg16L1三種變異體:Atg16L1-1蛋白

3、包含全長607氨基酸，包含coiled-coil區(qū)域和七段WD repeats重復結構域;Atg16L1-2蛋白缺失外顯子8序列相對應的區(qū)域;Atg16L1-3蛋白缺失coiled-coil區(qū)域。(2)細胞亞定位結果分析指出，Atg16L1-1與MDC（Monodansylcadaverine，一種自噬示蹤劑，簡稱MDC）追蹤的自噬泡共定位陽性點數(shù)為28.0±2.58 dots，高于Atg16L1-2(15.75±1.71 dots)和

4、Atg16L1-3(3.75±0.75 dots)(P＜0.001)。Atg16L1-1與溶酶體共定位陽性點數(shù)為37.67±1.75dots，高于Atg16L1-2（23.14±2.27 dots）和Atg16L1-3（13.0±1.58 dots）（P＜0.001）。Atg16L1-1和Atg16L1-3均可定位于線粒體，其相應的共定位陽性點數(shù)分別為14.33±1.53/cell和7.67±1.53/cell（P＜0.01），Atg1

5、6L1-2沒有在線粒體上定位。(3)過表達Atg16L1變異體對細胞自噬產(chǎn)生影響。共轉染Atg16L1-1變異體和GFP-LC312h后，檢測細胞內LC3-Ⅱ平均陽性點數(shù)（70.2±2.39 dots）高于Atg16L1-2(59.25±2.22 dots)和Atg16L1-3（48.25±2.22 dots）（P＜0.001）。共轉染Atg16L1-1變異體和GFP-LC324h后LC3-Ⅱ平均陽性點數(shù)均有不同程度降低，其平均陽性點數(shù)