具纖溶活性芽孢桿菌的研究.pdf

1、本文主要對具有纖溶活性的芽孢桿菌進行了研究，獲得的菌株其代謝產物——纖溶酶具有溶解血栓的主要成分(纖維蛋白)的特性，該菌株是從傳統的發(fā)酵豆制品中分離、篩選得到的，這為深入研究、開發(fā)傳統發(fā)酵食品的功能性具有十分重要的意義。 本課題主要對以下幾方面進行了研究：(1)傳統發(fā)酵食品的功能性。傳統發(fā)酵豆制品如豆豉、豆瓣醬、腐乳等通常作為食品被人們利用。本文以傳統發(fā)酵豆制品豆豉、腐乳、豆瓣醬、納豆等為菌源篩選材料得到產纖溶酶的菌株，確保了菌

2、源的安全性，并且開拓了利用傳統發(fā)酵食品的新途徑——功能性食品。 (2)篩選方法的確定。本課題為了確定適合的篩選產纖溶酶能力高菌株的方法，對比了不同菌株在酪蛋白平板和血纖維蛋白平板上的溶解圈趨勢，結果表明兩種篩選方法具有正相關性。從而確定采用酪蛋白平板代替血纖維蛋白平板作為初篩方法，具有快速、簡便、經濟的特點。同時本試驗也對傳統的血纖維蛋白平板進行了改良，利用哺乳動物血液系統與人類血液系統具有相似性的原理采用無菌綿羊血制成模擬血栓

3、來對菌株進行復篩，建立了準確的復篩方法。 (3)篩選產纖溶酶能力高的菌株。試驗采用酪蛋白平板初篩與血纖維蛋白平板復篩相結合的方法，以國內外大豆發(fā)酵食品為菌源篩選材料，從中共分離出64株產纖溶酶的菌株，經過初篩得到8株產纖溶酶活力高的菌株，通過對初篩菌株的進一步復篩得到2株產纖溶酶活力最高的菌株YL-P2、YL-F2，酶活力分別達到了1122IU/mL和1137IU/mL。根據菌株的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化等特征確定YL-P2

4、、YL-F2為枯草芽孢桿菌。 (4)對所篩選的菌株進行物理及化學誘變提高菌株產纖溶酶的能力。以枯草芽孢桿菌YL-P2、YL-F2作為出發(fā)菌株，分別采用紫外線(UV)誘變、硫酸二乙酯誘變、以及紫外線和硫酸二乙酯復合誘變，以酪蛋白平板法為初篩方法結合纖維蛋白平板復篩的方法選育纖溶酶活力高的菌株，獲得了高產纖溶酶突變株UV-8。UV-8纖溶酶活力達到2314IU/mL，與出發(fā)菌株相比酶活力提高了2倍。經10次傳代后菌株UV-8的纖溶酶

5、酶活力達到穩(wěn)定。 (5)對突變株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，產酶量達到最大。突變株UV-8在不同的發(fā)酵條件(溫度、接種量、起始pH值、裝液量)和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(碳源、氮源、金屬離子、表面活性劑)等單因子試驗基礎上，結合正交實驗得到該菌株的最適宜的液體發(fā)酵條件為：可溶性淀粉3％，酵母膏3％，吐溫600.25％，復合金屬離子0.2％，pH7.0，發(fā)酵溫度35℃，裝液量為50mL/250mL，4％接種量。 (6)對突變株UV-8代謝產

6、物的活性進行了初步研究。通過測定含有不同成分的纖維蛋白平板確定纖溶酶的纖溶方式，測定發(fā)酵液和細胞提取液的纖溶酶活力判斷菌株產纖溶酶為胞外酶還是胞內酶，通過加入不同飽和度的硫酸銨確定純化纖溶酶的最適硫酸銨飽和度，同時測定了菌株代謝產物的體外溶栓性能、抑菌等特性。結果表明UV-8代謝產物只有直接溶解纖維蛋白的功能而不能激活纖溶酶原發(fā)揮間接溶解血栓的作用。確定纖溶酶的硫酸銨沉淀點應該選在50％。纖溶酶對血凝塊的作用在12h和24h的溶解率分別