成花調控基因LFY的選擇性剪接及其功能研究.pdf

1、開花過程（即成花）在相當的程度上決定著繁育是否成功，是高等植物最關鍵的生命時期之一，近年來已成為植物生殖發(fā)育研究的新熱點，并且該領域的研究對農業(yè)和園藝生產有著重要意義。其中，LEY基因是目前研究得比較深入的成花相關基因之一。LFY基因作為花分生組織特性基因，被認為是很多植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的主要調控因子之一。
　　 真核生物基因的選擇性剪接極大地豐富了基因表達產物的多樣性和基因表達的復雜程度。選擇性剪接改變蛋白質結構域、

2、活性、定位，及影響蛋白質亞基或蛋白質間的互作、轉錄后調控，甚至產生無功能的產物。其在調控植物生長、發(fā)育、遺傳、免疫及抗性等方面的作用已越來越為研究者們所關注。而成花過程則恰恰是選擇性剪接等調控機制的有機組合和協(xié)調作用，因此，成花過程中涉及的選擇性剪接成為一個重要的研究部分。
　　 本研究進行了成花調控基因LFY的表達分析，及其可能的選擇性剪接研究，并通過基因轉移，對較少報道的LFY基因選擇性剪接產物（1275bp片段）進行一定的

3、功能驗證。意在研究LFY基因發(fā)生的可變剪接事件及其對LFY基因功能的影響。研究結果如下：
　　 1.用RT-PCR法克隆了LFY基因的兩個轉錄本cDNA，即1263bp片段和1275bp片段。序列分析結果表明，1263bp片段包含了完整的編碼序列。1275bp片段除包含除完整的編碼序列外，在第一外顯子和第二外顯子間還保留了第一內含子3’末端12bp序列。
　　 2.用RT-PCR法克隆了LFY基因發(fā)生可變剪接部位的三個片

4、段：LFY1239，LFY1263和LFY1275，分別代表了存在的三種可變剪接轉錄本。在營養(yǎng)生長期擬南芥蓮座葉中包含了三種，而在開花期的花器官和蓮座葉中只包含兩種（LFY1263，LFY1275）。序列比對結果顯示，轉錄本LFY1239缺失了第一外顯子靠近3’端的36bp片段可能導致LFY蛋白質在N末端缺失GTHHALDALSQE這12個氨基酸殘基而喪失活性，成為一個無功能的表達產物；轉錄本LFY1263包含從起始密碼到終止密碼的全部

5、開放閱讀框序列；轉錄本LFY1275在第一外顯子和第二外顯子間保留了第一內含子的3’端12bp片段。
　　 3.通過高濃度（3.5％）的瓊脂糖凝膠電泳分離，并利用BioSpectrum ImagingSystem自帶的VisionWorks LS軟件對電泳照片進行光密度分析。結果顯示LFY基因三種不同轉錄本在擬南芥不同生長發(fā)育階段其相對含量有所差異。表現為，LFY1263在三個分子中所占比例最大，結合已報道的證據，該轉錄本對開花

6、誘導有著重要意義。LFY1239只在營養(yǎng)生長期的蓮座葉被檢測到，并且編碼序列存在一定缺失，這是否提示其對擬南芥成花誘導作用不大? LFY1275和LFY1263在營養(yǎng)生長期和開花期均存在，兩轉錄本在不同時期蓮座葉中的相對比例較穩(wěn)定，在花器官中LFY1275相對于LFY1263的比例卻有所增加。但是，轉錄本LFY1275和LFY1263在擬南芥的生長發(fā)育和開花誘導過程中，是獨立作用還是協(xié)同作用，還需要深入的研究。
　　 4.用LF

7、Y1275 cDNA構建了植物組成型表達載體pBL1275，轉入根癌農桿菌GV3101菌株，并浸染多頭切花菊“綠寶石”品種無菌苗莖段材料，初步獲得了17株Kan抗性苗，其中PCR檢測陽性為9株，占抗性苗的52.94％。利用RT-PCR檢測了移栽2個月后的9株PCR陽性苗，其中7株為RT-PCR陽性，表明LFY1275能夠在轉化植株中表達。
　　 5.與未轉化植株相比，移栽的轉基因植株長勢較弱。部分植株出現分枝的主莖、側芽的提早分