層層自組裝與點擊化學修飾納米纖維制備“免疫調節(jié)”支架.pdf

1、可植入性醫(yī)用材料，包括組織工程與藥物釋放支架，目前的研究重點都放在力學強度、功能組分、拓撲結構、生物可降解性與表面化學性質等特性方面。但是，在臨床應用中，決定移植成敗的是組織重建過程中的免疫排斥反應。特別是納米纖維這種具有超高比表面積的組織工程支架，往往會因為非特異性吸附大量的蛋白而引起慢性炎癥，形成膠原纖維囊而導致功能喪失。目前的研究表明早期炎癥中巨噬細胞的分化對調節(jié)宿主免疫排斥反應、調控移植物與宿主的整合至關重要。不同于其他免疫細胞

2、（例如 T淋巴細胞）的高度分化狀態(tài)，巨噬細胞的M1/M2表型具有功能可塑性，可以根據(jù)微環(huán)境信號的類型、濃度、及持續(xù)時間的改變而進行動態(tài)調整。本研究的主要內容為通過層層自組裝的方式在納米纖維表面修飾絲素蛋白（Silk Fibroin，SF），降低材料的非特異性吸附，并通過點擊化學反應將肝素寡糖（Heparin Disaccharide，HD）固定于納米纖維表面用于特異性吸附細胞因子白介素4(Interleukin-4，IL-4）來主動調控

3、巨噬細胞的功能分化以降低植入體的免疫排斥反應，主要研究內容與結果如下：
　?、偻ㄟ^靜電紡絲制備聚己內酯（poly-ε-caprolactone，PCL）納米纖維，并通過層層自組裝和點擊化學的方式修飾納米纖維。掃描電鏡、共聚焦熒光顯微鏡、力學測試、厚度測試的結果顯示 SF的自組裝修飾不改變納米纖維的整體結構，但隨著組裝層數(shù)的增加，納米纖維的厚度增加；同時組裝過程中的90％甲醇處理增加了SF的β折疊，最終增加了納米纖維的力學強度。紅外

4、與紫外光譜的結果顯示通過點擊化學的方式在納米纖維表面固化HD具有可行性，固化后的納米纖維表面可以觀察到糖類的紅外特征峰。接觸角測試結果表明并且HD還能改善納米纖維的親水性。蛋白吸附分析結果表明SF的修飾降低了納米纖維的非特異蛋白吸附，而HD固化后可以特異性的結合細胞因子IL-4，為其調控免疫排斥反應打下良好的基礎。
　?、谠隗w外（in vitro）和體內（in vivo）驗證了IL-4作為免疫調節(jié)因子對納米纖維支架M1/M2型巨噬

5、細胞的功能調節(jié)能力。免疫熒光和免疫組化結果證明，在炎癥反應的開始階段，IL-4具有“功能性”激活巨噬細胞的能力，之后迅速地將M1型巨噬細胞轉化為M2型巨噬細胞。HE染色和MASSON膠原染色結果證明巨噬細胞的早期功能調節(jié)可以抑制免疫排斥反應，減少膠原纖維囊的產(chǎn)生。本研究首次將HD應用于納米纖維的表面功能化。實驗結果發(fā)現(xiàn)HD除了作為“橋梁”調節(jié)所綁定的細胞因子活性外，自身對巨噬細胞也有直接的調節(jié)作用，會降低巨噬細胞的極化從而減少免疫細胞的

6、招募。
　　③通過RNA轉錄組測序探討巨噬細胞在納米纖維上的分化機理。轉錄組整體質量評估，PCR驗證結果表明本次測序分析準確可靠，具有參考性。差異基因GO富集分析結果表明納米纖維影響巨噬細胞代謝、凋亡、周期、信號傳遞、免疫功能等行為。KEGG信號通路富集與可視化的分析結果表明TNF信號通道、PI3K-Akt信號通道、MAPK的JNK和ERK信號通道以及NF-κB的反饋機制在納米纖維調控巨噬細胞分化不同表型中起到重要作用，為后續(xù)研究