果蠅中一個新基因ecp的功能鑒定與分析.pdf

1、本文從野生型黑腹果蠅胚胎cDNA文庫中篩選并克隆得到ecp全長cDNA序列。生物信息學分析表明：ECP在進化過程中是十分保守的，從果蠅、斑馬魚到哺乳動物中均有其同源蛋白存在。從結構方面來看，ECP在其氨基端帶有一個亮氨酸拉鏈結構基序，羧基端帶有一個elF5C結構域。這一結構域是elF5與elF2β的結合位點，因而ECP可能與eIF2β相互作用進而參與翻譯過程。 RNA原位雜交及胚胎抗體染色的結果都表明：在果蠅胚胎中，ecp無論

2、在RNA水平上，還是在蛋白水平上都呈現(xiàn)廣泛表達和分布，沒有明顯的組織特異性。Western Blot結果表明，ECP在果蠅的胚胎、幼蟲、蛹及成蟲中都有持續(xù)的高表達。這些結果提示ecp可能是一個管家基因。GFP標記分析及S2細胞免疫熒光結果顯示，ECP主要分布在細胞質中，推測其可能通過與elF2β相互作用而參與翻譯過程。 Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，ECP蛋白在果蠅中存在兩種遷移率不同的形式，ECP-S和ECP-F。從這兩

3、種形式在果蠅不同發(fā)育階段所呈現(xiàn)的切換規(guī)律，即：胚胎、蛹和成蟲都主要表達電泳遷移率較慢的形式(ECP-s)，伴隨著果蠅胚胎孵化成幼蟲時即開始表達遷移率較快的形式(ECP-F)，并持續(xù)到三齡幼蟲開始蛹化時又逐漸被ECP-S替代，這些結果表明。ECP-F可能與幼蟲的生長發(fā)育有關。 通過免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)多種核糖體大小亞基蛋白能被抗ECP單抗所沉淀。與此同時，蔗糖密度梯度離心的結果也表明：有部分ECP能與40S、60S核糖體亞基結合。

4、通過酵母雙雜交，我們找到了兩個可能與ECP相互作用的蛋白質，elF2β和RPL5。這些結果表明ECP可能是一種核糖體相關蛋白，又因其可以和翻譯起始因子eIF2β相互作用，因而ECP可能在翻譯起始過程中起某種作用。 S35-Methionine摻入實驗表明，通過RNAi抑制S2細胞中ECP的表達后，蛋白質合成速率下降約45％。另一方面，在ecp的第一個內含子帶有P因子插入突變的果蠅1(3)03022表現(xiàn)為短剛毛，生長發(fā)育遲緩，翅