熒光標記公用引物片段長度差異復合擴增21個SNPs位點的多態(tài)性及法醫(yī)學應用的研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因組內特定核苷酸位置上存在著兩種不同等位基因，其中最少的一種在群體中的頻率不少于1％。單核苷酸多態(tài)性因其占人類基因組中多態(tài)性的90%以上而受到廣泛關注。其特點包括以下幾點：首先，位點豐富。SNP分布于整個基因組，據估計，基因組中大約平均每1000bp就會出現1個SNP，從而使其在整個基因組的分布可達300萬之多。其次，突變率低，每代每堿基突變率

2、約為2×10-8。尤其是位于編碼區(qū)的SNP(coding region SNP，cSNP)，呈高度穩(wěn)定性。第三，SNPs位點為單堿基變異，可分析片段短小，更適合PCR擴增及降解DNA的分析。第四，SNPs適于快速、高通量檢出。其二態(tài)變異，易于判型，有利于發(fā)展自動化的篩選或檢測技術。第五，SNPs多態(tài)性在不同人種和/或群體中的分布有所不同，可用于人類遺傳學、疾病相關性及法醫(yī)學研究。
　　 由于SNPs具有上述特點，不僅很快成為醫(yī)學

3、、藥學、臨床診斷學的研究熱點，而且在法庭科學生物物證鑒定領域，尤其在解決降解生物檢材個體識別方面也引起學者們的極大關注。在法庭科學生物物證鑒定領域中，對于保存條件較好，DNA分子比較完整的生物檢材，應用現有的DNA分析技術都能較好的解決。但是，對于保存條件差，DNA分子不完整的降解生物檢材尚不能有效解決，這也是當前面臨的難題之一。SNP可分析片段短小，更適合降解DNA的分析，因此通過積極開展相關研究，有可能建立一種行之有效的適合這類檢材

4、分析的新技術手段。
　　 SNPs位點突變率低，遺傳穩(wěn)定，也是分析人類起源、遷移等比較理想的遺傳標記。Sanchez JJ等對索馬里、土耳其、丹麥、德國、格陵蘭、日本、泰國、臺灣和中國大陸9個地區(qū)700名無關個體的52個SNPs位點進行分析，通過計算不同種族和民族間的遺傳距離，認為亞洲人群中臺灣和大陸人群關系最近，其次是二者與泰國人群的關系，再次為與日本人群的關系；研究表明所調查的亞洲人群與其它人群的關系較遠，從近到遠依次為格陵

5、蘭、德國、丹麥、土耳其，最遠的為索馬里?？略胶５韧ㄟ^對中國各地9988例男性隨機樣本Y染色體M89，M130和YAP3個單倍型分析，認為Y染色體的證據支持現代中國人起源非洲假說。劉烜等對我國貴州地區(qū)布依族、仡佬族、仫佬族、毛南族、壯族5個少數民族10個SNPs構成的Y染色體單倍型分析，認為這5個民族之間遺傳關系密切，與國內其他民族有較大的遺傳差異，是相對獨立的群體。
　　 雖然目前分析SNP的方法有多種，但普遍存在兩個方面問題。

6、一是，一些無需專用SNP分析設備的方法，如RFLP、SSCP方法，或者是檢測通量低，一次只能檢測出單個SNP位點，獲得的信息量少，或者是實驗操作繁瑣，檢測過程費時，如SNaPshot，均不適合法庭科學領域的高通量檢測需求；二是，另一些操作簡單檢測通量高的方法均需要借助昂貴的SNP分析專項設備和配套試劑實現，不利于方法本身的推廣，例如DHPLC、基因芯片法、MALDI-TOF MS等方法。
　　 為解決法庭科學生物物證鑒定領域降解

7、生物檢材的鑒定問題，了解多位點SNPs在中國不同民族人類遺傳學、法醫(yī)學意義并解決現有SNP分析技術的瓶頸問題，本研究結合當前法庭科學實驗室普遍采用熒光標記和毛細管電泳分離技術的實際情況，開展了具有普遍適用性的基于毛細管電泳分離技術的熒光標記多位點SNP分型技術研究，旨在建立一種高效率、低成本、快速準確的多位點SNP分型技術。并通過調查常染色體更多SNPs位點在中國不同民族中基因頻率調查，以了解SNPs在中國不同民族中的分布狀態(tài)，在此基礎

8、上進一步分析不同民族間的遺傳關系，并根據調查結果評估復合擴增21個SNPs在法庭科學中的應用價值。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、中國漢、蒙、壯三個民族的血痕樣本
　　 遼寧地區(qū)漢族健康無關個體血痕樣品203份；內蒙古自治區(qū)蒙古族健康無關個體血痕樣品152份；廣西壯族自治區(qū)壯族健康無關個體血痕樣品184份。
　　 2、靈敏度測定樣品：干血濾紙一份，來自本實驗室。
　　 3

9、、DnaseI降解實驗樣品：新鮮血液約2ml，來自本實驗室健康自愿者。
　　 4、親子關系分析樣品：為10個待確認的父-子-母三聯體共30份干血濾紙，來自本實驗室日常實際案例。
　　 5、組織同一性分析樣品：為同一個體不同組織的心、肝、脾、肺、腎、肌肉及大腦7份組織，來自本實驗室。
　　 6、實際案件中樣品：20份血痕、10份肌肉、15枚煙蒂，10份軟骨，8份性犯罪混合斑，來自日常案件積累。
　　 二、實

10、驗方法
　　 (一)建立熒光標記公用引物片段長度差異SNPs復合擴增技術
　　 1、SNP位點篩選
　　 根據http：//www.hapmap.org網站，從1-22號染色體中篩選45個SNPs位點作為備選。
　　 2、SNP位點引物設計、合成
　　 根據熒光標記公用引物和等位基因特異性引物原理，同時在特異性引物序列引入錯配的堿基，構建多位點SNPs復合擴增引物體系，應用Primer5.0軟件設

11、計引物。SNP特異性引物送上海生工生物公司合成，熒光標記公用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
　　 3、建立SNPs復合擴增體系
　　 經單位點、分小組、合并組逐級擴大PCR擴增，層層淘汰不合格引物，篩選出可以進行復合擴增的SNPs位點。
　　 4、SNPs復合擴增體系的優(yōu)化
　　 對起關鍵作用的引物退火溫度、不同位點間引物濃度配比及DNA聚合酶等重要因素進行優(yōu)化，以完善復合擴增體系。
　　

12、 5、SNPs分型結果的測序驗證
　　 針對每個SNP位點重新設計兩條測序引物，擴增包含SNP位點在內的序列，精制模板后單向測序，驗證SNP分型結果的準確性。
　　 (二)調查3個民族21個SNPs位點基因頻率分布及法醫(yī)學意義評價
　　 采用本研究建立的SNPs復合擴增技術，對我國遼寧地區(qū)漢族、內蒙古地區(qū)蒙古族和廣西地區(qū)壯族人群進行基因頻率調查，并對3個民族21個SNPs位點等位基因頻率分布進行Hardy-Wei

13、nberg平衡檢驗；通過X2檢驗對3個民族21個SNPs位點的基因分布進行比較分析；通過聚類分析方法分析三個民族間的遺傳關系；根據3個民族的調查結果，計算各民族21個SNPs位點的雜合度、多態(tài)信息總量、個人識別幾率和非父排除率，以評估21個SNPs位點復合擴增的法醫(yī)學應用價值。
　　 (三)熒光標記公用引物片段長度差異21個SNPs復合擴增的法醫(yī)學應用
　　 應用本研究建立的復合擴增技術，對DNA最小檢出量、組織同一性、

14、21個位點的遺傳穩(wěn)定性以及不同種類生物檢材的檢驗有效性進行了驗證實驗。為了解本方法對降解生物檢材的檢測能力，使用Dnasel進行降解實驗，并與STR檢測結果進行平行比較。用21個SNPs復合擴增技術和AmpF1STRTMSinofiler STRs檢測試劑盒，對10個待確認親子關系的父-母-子三聯體案例同時進行親權鑒定，通過結果比較，探討本方法在法醫(yī)學個人識別和親子鑒定的可靠性和實用性。
　　 結果與討論
　　 一、熒光

15、標記片段長度差異21個SNPs復合擴增技術的建立
　　 本研究建立的SNPs復合擴增基本原理：每個SNP位點有三條擴增引物，兩條上游、一條下游引物，每條引物由特異性序列和公用尾部序列兩部分構成。上游引物的3’末端堿基分別與SNP位點的兩個等位基因對應，并且在距3’末端的第3位堿基處分別引入一個錯配堿基，以提高PCR擴增特異性。公用尾部序列有三種(Uni1，Uni2和Uni3)，上游引物中的一條連接公用尾部序列Uni1，另一條連接

16、公用尾部序列Uni2，下游引物連接公用尾部序列Uni3。
　　 公用引物有U1、U2、U3三條，U1和U2分別用熒光標記物HEX(綠色)和6-FAM(藍色)標記。以利于基因型判定。
　　 本研究復合擴增體系建立采用分階段分組完成。首先，進行單位點擴增，淘汰不合格位點；其次，分小組復合擴增，每組約5個位點引物，刪除不合格位點；再次，合并小組，每組各10-11個SNPs位點，進一步淘汰不合格位點；最后，將所有合格的位點合并成

17、一組，進一步淘汰不合格擴增位點。經過逐級擴大、層層淘汰，最終確定了21個SNPs位點復合擴增體系。在此復合擴增體系中又加入了用于性別鑒定的Amelogenin基因的擴增引物。
　　 本研究建立的SNPs復合擴增技術對21個常染色體SNPs位點和人牙釉質蛋白Amelogenin基因一次性單管擴增，經毛細管電泳后，每個SNPs位點純合子為單一產物峰，雜合子為兩個片段長度相同，呈現藍、綠兩種染色的產物峰，可以正確區(qū)分并判定基因型。隨機

18、選取6份用本研究方法分型的樣品，對每個SNP位點逐一測序驗證。結果顯示，6份樣品熒光標記SNPs復合擴增分型結果與直接測序結果完全一致，證明本方法結果準確、可靠，是一種快速、簡單、高效且較為實用的SNPs分型新方法，適用于大樣本量的多位點SNPs的同步分型。
　　 二、我國3個民族21個SNPs位點的基因分布
　　 調查結果顯示，21個SNPs位點等位基因在遼寧地區(qū)漢族、內蒙古地區(qū)蒙古族、廣西地區(qū)壯族3個民族群體中均具有

19、多態(tài)性。Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示，X2值分別在0.001-1.617、0.002-1.65和0.005-1.53之間，P值均大于0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明選取的三個群體樣本具有代表性。
　　 我國3個民族21個SNPs位點基因頻率的比較結果表明：在遼寧漢族和內蒙古蒙古族之間，有2個SNPs位點rs1014440、rs1010870的基因多態(tài)性分布呈極顯著差異(P≤0.001)，1個位點r

20、s1022690有差異(P≤0.05)，其余18個SNPs位點的基因分布沒有差異(P≥0.05)；在遼寧漢族和廣西壯族之間，5個SNPs位點rs10003686、rs1022106、rs116187、rs1014440和rs1010870的基因分布有極顯著差異(P≤0.001)，7個位點rs10005781、rs1024283、rs1001389、rs101570、rs10519137、rs1018427和rs112603(P≤0.05

21、)有差異，其余9個位點沒有差異(P≥0.05)；在內蒙古蒙古族和廣西壯族之間，3個SNPs位點rs1022106、rs116187和rs1014440的基因分布有極顯著差異(P≤0.001)，3個位點rs10003686、rs1024283和rs1001389有差異(P≤0.05)，其余15個位點的基因分布沒有差異(P≥0.05)，由此可見，三個民族在多個SNPs位點上的等位基因分布具有顯著性差異。
　　 本研究采用歐氏距離平方

22、法對3個民族21個SNPs位點共126個等位基因頻率的數據進行聚類分析，結果顯示，遼寧漢族與內蒙古地區(qū)蒙古族之間的歐氏不相似系數最小，為0.348；內蒙古地區(qū)蒙古族與廣西地區(qū)壯族之間的歐氏不相似系數次之，為0.415；遼寧地區(qū)漢族與廣西地區(qū)壯族之間的歐氏不相似系數最大，為0.647。說明遼寧地區(qū)漢族與內蒙古地區(qū)蒙古族的親緣關系比遼寧地區(qū)漢族與廣西地區(qū)壯族的親緣關系更近。
　　 根據21個SNPs位點在遼寧地區(qū)漢族、內蒙古地區(qū)蒙古

23、族和廣西地區(qū)壯族的等位基因頻率調查結果，計算出各位點在不同民族的多態(tài)性信息量(PIC)、雜合度(H)、個人識別幾率(Dp)和非父排除率(PE)。
　　 遼寧漢族群體的21個SNPs位點多態(tài)信息總量在0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs1007469和rs116187位點，均為0.5320，最小的是rs1010870位點，為0.3547；個人識別幾率最大的是rs101570位點，為0.6374，最小的是rs1010870位點，

24、為0.5056；非父排除率最大的是rs1003416，為0.1875，最小的是rs1010870位點，為0.1409；21個SNPs位點累積個人識別幾率為0.999999997，累積非父排除率為0.984769502。
　　 內蒙古地區(qū)蒙古族群體的多態(tài)信息總量位于0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs10005781，為0.5461，最小的是rs112603位點，為0.3487；個人識別幾率最大的是rs101570位點，為0.

25、6269，最小的是rs112603位點，為0.5314；非父排除率最大的是rs10005781和rs1010870，均為0.1874，最小的是rs112603位點，為0.1491；21個SNPs位點累積個人識別幾率為0.999999996，累積非父排除率為0.984646。
　　 廣西地區(qū)壯族群體的多態(tài)信息總量均位于0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs1010870位點，為0.5272，最小的是rs10003686位點，為0

26、.3587；個人識別幾率最大的是rs1018427位點，為0.6419，最小的是rs10003686位點，為0.4998；非父排除率最大的是rs1001389和rs1018427，均為0.1875，最小的是rs10003686位點，為0.1391；21個SNPs位點累積個人識別幾率為0.999999995，累積非父排除率為0.98236771。
　　 以上數據表明，本研究選擇的21個SNPs位點在中國遼寧地區(qū)漢族、內蒙古地區(qū)蒙古

27、族、廣西地區(qū)壯族3個民族中具有較好的多態(tài)性分布，聯合使用這21個SNPs位點遺傳標記的累積個人識別幾率和累積非父排除率均分別達到99.999999%和98％以上。因此認為，應用本研究建立的熒光標記公用引物片段長度差異復合擴增體系，進行21個SNPs遺傳標記的基因分型，在法醫(yī)學個人識別和親子鑒定中具有較高的系統(tǒng)效能和應用價值。
　　 三、熒光標記SNPs復合擴增技術的法醫(yī)學應用研究
　　 本研究對所建立的方法，進行了在法庭

28、科學領域應用前的有效性驗證實驗，包括靈敏度、組織同一性、遺傳穩(wěn)定性及不同種類生物性檢材的檢驗。同時，為了解此方法對降解生物檢材的分析能力，利用DnaseI進行降解實驗，并與STR復合擴增方法進行了平行比較。
　　 實驗結果表明，21個SNPs位點的復合擴增體系檢測的最低檢測限為125pg；來自同一個體心、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦7種不同組織的21個SNPs位點及Amelogenin位點分型一致，證明本研究建立的方法比較靈敏，具

29、有穩(wěn)定性。
　　 對63份日常實際案件中血痕、肌肉、煙蒂、軟骨及混合斑檢材進行分析，均獲得滿意的分型結果。表明本研究方法對常見生物檢材同樣具有良好的適用性。
　　 將本研究建立的方法應用于兩起刑事案件，獲得的同一比對結果得到了AmpF1STRTM Sinofiler試劑盒STR分型結果的進一步支持。證明本研究建立的方法可以進行生物性檢材的同一比對。
　　 本研究對經DnaseI瞬時和5分鐘降解的DNA樣品進行分析

30、，并使用AmpF1STRTMSinofiler試劑盒和AmpF1STRTM MiniFilerTM試劑盒進行平行比較，結果表明，應用本研究建立的21個SNPs位點的復合擴增體系比常規(guī)STR試劑盒及MiniSTR試劑盒具有更高的檢測成功率。
　　 對10個待確認親子關系的二代三聯體的分析結果顯示：21個SNPs位點均未發(fā)現變異，10個案例均未排除生物學親子關系。同時采用AmpF1STRTM Sinofiler試劑盒檢驗15個STR

31、位點作為對照，所得結論與SNPs檢測結果一致。說明本研究建立的21個SNPs位點復合擴增技術可以應用于親子鑒定。
　　 綜上所述，本研究建立的熒光標記片段長度差異21個SNPs位點復合擴增技術，可以應用于人類遺傳學、疾病相關性研究以及法醫(yī)學個人識別和親子鑒定。
　　 結論
　　 1、本研究建立的熒光標記公用引物片段長度差異SNPs復合擴增技術，結果準確、可靠，是一種簡單、快速、有效且實用的又一種SNP多態(tài)性分析方

32、法，可用于21個SNPs基因的同步分型。
　　 2、我國遼寧地區(qū)漢族、內蒙古蒙古族和廣西壯族21個SNPs位點的等位基因分布具有多態(tài)性。抽樣調查符合Hardy-Weinberg平衡。
　　 3、21個SNPs位點在三個民族中有多個位點的等位基因頻率具有顯著性差異(P≤0.01)。遼寧地區(qū)漢族與內蒙古地區(qū)蒙古族的親緣關系更為接近，與廣西地區(qū)壯族的親緣關系較遠。
　　 4、熒光標記公用引物片段長度差異復合擴增21個S