直流電場(chǎng)對(duì)雞胚卵黃囊膜血管缺血模型的影響.pdf

1、目的：通過(guò)建立雞胚卵黃囊膜（Yolk sac membrane，Sac）血管缺血模型，探討外源性直流電場(chǎng)（Direct Current Electric Field，DCEF）對(duì)血管生長(zhǎng)模式的影響，為進(jìn)一步研究外源性直流電場(chǎng)對(duì)組織缺血損傷的組織再生修復(fù)的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將受精羅曼雞雞胚用75％酒精溶液消毒，置于孵化箱內(nèi)孵化，溫度37.5℃，濕度>70%；孵化72h后制作羅曼雞雞胚體外模型（outshell模型)，其中5枚

2、置于解剖顯微鏡下觀察并記錄雞胚Sac膜血流情況，根據(jù)血流情況利用 Photoshop軟件創(chuàng)建圖層繪制雞胚Sac膜血管模擬圖。再將雞胚outshell模型40枚隨機(jī)分為4組，每組10枚，A組為對(duì)照組，不做處理；B組為結(jié)扎組，僅結(jié)扎右側(cè)腹主血管；C組為不結(jié)扎右側(cè)腹主血管，但加載DCEF40mV/mm，其中胚體左側(cè)為正極，右側(cè)為負(fù)極；D組為結(jié)扎右側(cè)腹主血管血管后加載DCEF40mV/mm，其中胚體左側(cè)為正極，右側(cè)為負(fù)極。將A、B、C、D組均置

3、于恒溫恒濕箱內(nèi)繼續(xù)孵化，溫度37.5℃，濕度>70%，并利用CANON EOS Unitity軟件連接電腦對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)拍攝，間隔30min拍攝一次，共拍攝24h，其中A組雞胚拍攝24h后繼續(xù)孵育直至雞胚死亡，并記錄雞胚體外存活時(shí)間；將拍攝的圖片整理后分別獲得0h,6h,12h,18h,24h的雞胚血管圖形，利用Photoshop軟件對(duì)圖片的灰度及明度值進(jìn)行處理，Image J軟件分析血管的長(zhǎng)度、角度及密度變化。其中B、D組還需記錄結(jié)

4、扎后右側(cè)再生主血管出現(xiàn)的時(shí)間及生長(zhǎng)方向。
　　結(jié)果：
　　1.有效的建立了雞胚Sac膜體外模型，在溫度37.5℃，濕度>70%的孵育箱內(nèi)雞胚能存活并繼續(xù)發(fā)育，平均存活時(shí)間達(dá)82.65±14.07h（n=10）；
　　2.通過(guò)觀察雞胚Sac膜血管內(nèi)血液流經(jīng)情況（n=5），發(fā)現(xiàn)雞胚sac膜共有兩套基本對(duì)稱生長(zhǎng)的血管：（1）腹主動(dòng)脈及伴行靜脈與背主動(dòng)脈及伴行靜脈。腹主動(dòng)靜脈位于胚體右側(cè)，背主動(dòng)靜脈位于胚體左側(cè)，且該套血管在正

5、常發(fā)育過(guò)程中均不會(huì)越過(guò)胚體的中軸線；（2）位于胚體上下方的血管均為靜脈血管分別為上極靜脈及下極靜脈；
　　3.有效的建立了雞胚Sac膜血管缺血模型，結(jié)扎右側(cè)腹主血管后，左側(cè)血管的生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)角度均會(huì)發(fā)生一定的改變，并能與右側(cè)再生血管形成新的交通支；
　　4.（1）左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)速度：左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)速度與結(jié)扎右側(cè)腹主血管、DCEF加載及DCEF加載方向均有關(guān)系:1）當(dāng)Cosα0>0即DCEF加載后電場(chǎng)方向與血管生長(zhǎng)方

6、向夾角<90°時(shí)，結(jié)扎右側(cè)腹主血管及電場(chǎng)加載均會(huì)促進(jìn)血管生長(zhǎng)，組間同一時(shí)段比較均有D>B>C>A（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但同一刺激因素下，血管生長(zhǎng)速度的變化與孵育時(shí)間關(guān)系不大（24h內(nèi)），組內(nèi)不同時(shí)間段生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異（P>0.05）。2）當(dāng)cosα0<0即DCEF加載后電場(chǎng)方向與血管生長(zhǎng)方向夾角>90°時(shí)，結(jié)扎右側(cè)腹主血管對(duì)血管生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，DCEF隨著時(shí)間增加會(huì)抑制血管生長(zhǎng)速度，組間同一時(shí)段比較（6h-0h），均有B

7、，D>A，C（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但B組與D組之間，A組與C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著孵育時(shí)間增加到6h以后，DCEF對(duì)逆于電場(chǎng)方向生長(zhǎng)的血管具有一定的抑制作用，12h-6h,18h-12h,24h-18h組均有:B,D>A>C(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一組內(nèi)不同時(shí)間段中，C組中：6h-0h組>12h-6h組>18h-12h組,24h-18h組(P<0.05),即生長(zhǎng)速度隨加電時(shí)間增加會(huì)受到抑

8、制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組中，24h-18h組生長(zhǎng)速度慢于前三組時(shí)段(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未加電組（A、B組）組內(nèi)不同時(shí)段生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異。3）DCEF對(duì)血管生長(zhǎng)的促進(jìn)與否與DCEF加載方向有關(guān)，正向加電對(duì)血管生長(zhǎng)速度促進(jìn)作用明顯大于逆向加電；同一組同一時(shí)間段內(nèi)，C組與D組的Cosα0>0組血管生長(zhǎng)速度大于Cosα0<0組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）血管偏轉(zhuǎn)角度的變化：左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)偏轉(zhuǎn)角度的變化與結(jié)扎

9、右側(cè)腹主血管及DCEF加載均有關(guān)系,且結(jié)扎右側(cè)腹主血管對(duì)左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)角度的變化要大于DCEF加載的影響。同一時(shí)間段內(nèi)均有：D>C>B>A（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一組內(nèi),分別在B、C、D組中其余時(shí)間段血管偏轉(zhuǎn)角度的變化均比24h-18h組血管偏轉(zhuǎn)角度變化大（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）左側(cè)血管生長(zhǎng)密度的變化主要與孵育時(shí)間及結(jié)扎右側(cè)腹主血管綜合因素有關(guān)，與DCEF加載與否關(guān)系不大。不同組相同時(shí)間點(diǎn)，在24h時(shí)

10、有B，D組（結(jié)扎組）>A，C組（未結(jié)組）(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B與D、A與C之間無(wú)明顯差異（P>0.05），其余時(shí)間點(diǎn)各組之間無(wú)明顯差異；同一組內(nèi)，僅B組及D組在18h、24h時(shí)與0h時(shí)相比密度有所增加(P<0.05)。（4）血管再生情況：B組再生主血管出現(xiàn)的時(shí)間遲于D組再生主血管出現(xiàn)的時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；再生主血管生長(zhǎng)方向與水平方向的夾角：B組>D組，差異明顯（P<0.05），即D組再生主血管生長(zhǎng)方向

11、與水平方向（電場(chǎng)方向）的夾角更小。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備雞胚Sac膜體外培養(yǎng)模型及血管缺血模型，并且證實(shí)了對(duì)雞胚Sac膜血管進(jìn)行定向調(diào)控具有可行性；
　　2.建立了雞胚Sac膜血管的生長(zhǎng)速度、角度及密度的研究方法；
　　3.（1）左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)速度與DCEF加載、DCEF加載后的電場(chǎng)方向、血管結(jié)扎導(dǎo)致的組織局部缺血缺氧有關(guān)，當(dāng)血管生長(zhǎng)方向與電場(chǎng)方向一致時(shí)，DCEF對(duì)血管生長(zhǎng)起促進(jìn)作用；當(dāng)血管生長(zhǎng)方向與

12、電場(chǎng)方向相反時(shí)，DCEF對(duì)血管生長(zhǎng)起抑制作用；其中局部缺血缺氧對(duì)血管生長(zhǎng)速度的影響要大于DCEF對(duì)血管生長(zhǎng)速度的影響，當(dāng)血管生長(zhǎng)方向與電場(chǎng)方向一致時(shí)二者具有協(xié)同作用。（2）左側(cè)終末支血管生長(zhǎng)的角度偏轉(zhuǎn)與DCEF加載及組織局部缺血缺氧有關(guān)，血管會(huì)向著電場(chǎng)方向、缺血缺氧部位偏轉(zhuǎn)，組織局部缺血缺氧對(duì)左側(cè)終末支血管偏轉(zhuǎn)角度的影響大于DCEF對(duì)血管偏轉(zhuǎn)角度的影響。隨著時(shí)間增加，當(dāng)血管偏轉(zhuǎn)角度達(dá)到一定程度后，角度的變化會(huì)隨著時(shí)間的增加而減小。（3）