模擬微重力對K562細(xì)胞紅系分化及細(xì)胞骨架的影響研究.pdf

1、研究背景：
　　航天飛行會導(dǎo)致人體血液、消化、生殖、心血管、免疫和骨骼等多個器官系統(tǒng)的功能改變?？臻g環(huán)境對人類機(jī)體的影響已成為科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。微重力環(huán)境與地球上1g的重力環(huán)境不同，又稱零重量，它是空間環(huán)境的主要特點之一。研究航天飛行過程中微重力環(huán)境對航天員健康的影響，探討其發(fā)生機(jī)理及制定有效的防治措施已成為一項迫在眉睫的任務(wù)。血紅蛋白總量和紅細(xì)胞數(shù)量的減少、紅細(xì)胞體積的減小早在20世紀(jì)就引起了航天醫(yī)學(xué)家們的重視，他們把這種現(xiàn)象

2、稱為“航天貧血癥”(spaceflight anemia)。目前科學(xué)家們尚未能解釋這一現(xiàn)象發(fā)生的原因，但有研究表明微重力可能是通過影響造血干細(xì)胞的分化和凋亡而引起貧血現(xiàn)象。
　　紅細(xì)胞的生成是一個復(fù)雜的過程，包括造血干細(xì)胞發(fā)育為原成紅細(xì)胞再進(jìn)一步分化為成熟紅細(xì)胞，期間各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用使得這一過程達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子家族中GATA家族和Ets家族在紅系分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。GATA家族是含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家

3、族，其中GATA-1和GATA-2主要分布在肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、紅系和巨核系的細(xì)胞中。GATA-1是造血系統(tǒng)特有的轉(zhuǎn)錄因子，主要在紅系發(fā)育晚期表達(dá)，為正常紅細(xì)胞發(fā)育所必需，它能激活多種紅系分化特有基因，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞向紅系分化，并且在細(xì)胞向紅系分化時表達(dá)顯著上升。GATA-1表達(dá)的增加也是K562細(xì)胞向紅系分化成熟的一個重要標(biāo)志。GATA-2則主要在多能的前體細(xì)胞中表達(dá)，對未成熟的造血細(xì)胞的增殖與維持有重要意義。過表達(dá)GATA-2會抑制

4、細(xì)胞向紅系分化，促進(jìn)其向巨核系分化。Ets家族是轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的一個家族之一，其中Ets-1在造血系統(tǒng)的調(diào)控中扮演著重要角色，它能調(diào)控淋巴細(xì)胞的生成和NK細(xì)胞的發(fā)育，在紅系分化過程中起負(fù)向調(diào)控作用。Ets-1可以通過上調(diào)GATA-2的表達(dá)從而抑制紅系分化，同時Ets-1還與GATA-2在紅系分化過程中起協(xié)同作用。綜上，任何一個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常均可能導(dǎo)致造血干/祖細(xì)胞紅系分化障礙。
　　細(xì)胞骨架是微管、中間纖維和微絲組成的纖維狀

5、聚合物與細(xì)胞膜上黏附斑、細(xì)胞間連接等特殊結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系，與各種調(diào)控蛋白交錯連接，并與細(xì)胞核的支架系統(tǒng)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。微管由α和β微管蛋白組成，正常時以β二聚體即β-Tubulin形式存在，具有維持細(xì)胞形態(tài)、輔助細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ?，在真核?xì)胞的染色體分離中發(fā)揮重要作用。中間纖維的化學(xué)組成比較復(fù)雜，主要由波形蛋白(Vimentin)構(gòu)成，與核基質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)核內(nèi)基因的表達(dá)影響細(xì)胞分化。微絲是一個實心狀的纖維，主要以F-actin多聚體形

6、式存在，是遷移的主要驅(qū)動力，在細(xì)胞的運(yùn)動過程中起了重要的作用。細(xì)胞骨架是外力發(fā)揮作用和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)力刺激的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，細(xì)胞可以通過細(xì)胞骨架感受重力通過物理和化學(xué)信號途徑傳導(dǎo)的力學(xué)信號。細(xì)胞骨架是非?；钴S的系統(tǒng)，它的單體和聚合體之間可以相互轉(zhuǎn)化發(fā)生改變，正是這種動態(tài)結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞骨架在感知微重力上發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞的骨架蛋白表達(dá)異常會導(dǎo)致細(xì)胞骨架受損可影響細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。微重力條件下細(xì)胞膜蛋白感受微重力所致的細(xì)胞骨架的變化可以激活ERK

7、、P38和JNK等下游的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子及jun、c-fos等基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分化的改變機(jī)制與細(xì)胞骨架的改變有關(guān)。綜上，細(xì)胞骨架中任何組分發(fā)生異常導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞均可能影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。因此，本實驗即通過檢測K562細(xì)胞的分化、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及細(xì)胞骨架的表達(dá)情況研究模擬微重力對K562細(xì)胞分化的影響及可能機(jī)制。
　　研究者目前通過航天空間站和地面模型兩種

8、方式獲得微重力來進(jìn)行相關(guān)的生命科學(xué)研究。由于空間研究機(jī)會少、實驗周期長、費用昂貴不能廣泛的應(yīng)用于實驗。地面微重力研究主要應(yīng)用小鼠尾吊模型及微重力效應(yīng)模擬裝置進(jìn)行各種實驗。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary cell culture system，RCCS)是目前公認(rèn)的地面微重力效應(yīng)模擬培養(yǎng)裝置，其所得實驗結(jié)果和真實微重力下實驗結(jié)果有很好的相關(guān)性，可以用來行微重力相關(guān)實驗的研究。本實驗使用第四代RCCS(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境，觀察該環(huán)

9、境下K562細(xì)胞紅系分化的情況并探索其可能機(jī)制。K562細(xì)胞株是具有向終末紅系、巨核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系等多向分化潛能的人紅白血病細(xì)胞。由于造血干細(xì)胞獲取困難、培養(yǎng)周期較長，K562細(xì)胞株已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于紅系分化研究模型中。氯化高鐵血紅素(Hemin)是常見的紅系分化誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞和K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的合成。
　　研究目的：
　　本實驗旨在研究模擬微重力對K562細(xì)胞紅系分化的影響以進(jìn)一步探究“航天貧血癥”發(fā)生

10、的可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　本實驗采用第四代旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS-4)模擬微重力環(huán)境，采用人紅白血病來源的K562細(xì)胞株作為造血干/祖細(xì)胞模型。實驗分為兩部分，第一部分實驗采用Hemin作為K562細(xì)胞紅系分化的誘導(dǎo)劑，將實驗分為正常重力(normal gravity)培養(yǎng)組（NG組），Hemin誘導(dǎo)組（Hemin組），模擬微重力(simulatedmicrogravity)培養(yǎng)組（SMG組）和模擬微重力下Hem

11、in誘導(dǎo)組（Hemin+SMG組）。培養(yǎng)K562細(xì)胞48h后采用聯(lián)苯胺染色法觀察四種培養(yǎng)條件下K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的表達(dá)情況;分別培養(yǎng)K562細(xì)胞6h、12h、24h、48h后采用實時熒光定量PCR(Reverse Transcriptase-quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測四種培養(yǎng)條件下紅系分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、GATA-2和Ets-1的mRNA表達(dá)水平。第二部分實驗分為NG組和SMG組，培養(yǎng)K562

12、細(xì)胞24h后采用間接免疫熒光法觀察兩種培養(yǎng)條件下K562細(xì)胞骨架蛋白F-actin、β-Tubulin和Vimentin的熒光強(qiáng)度;采用RT-qPCR法檢測6h、12h、24h、48h細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的mRNA表達(dá)水平;Western blot法檢測12h、24h細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。本研究不同時間點之間無相關(guān)性，為獨立重復(fù)實驗，每組實驗重

13、復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件，計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩樣本t檢驗及ANOVA法分析比較，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)果：
　　(1) Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率明顯高于NG組，SMG+Hemin組聯(lián)苯胺染色陽性率顯著低于Hemin組。
　　(2) Hemin處理K562細(xì)胞后，GATA-1基因表達(dá)水平在12h后升高，GATA-2基因表達(dá)水平在12h后降低，Ets-1基因表達(dá)水平在6h即

14、出現(xiàn)明顯降低;模擬微重力處理K562細(xì)胞后，GATA-1基因表達(dá)水平在24h后明顯降低，GATA-2基因表達(dá)水平在12h后升高，Ets-1基因表達(dá)水平在24h后出現(xiàn)明顯升高;模擬微重力和Hemin共同處理的K562細(xì)胞與單純Hemin誘導(dǎo)細(xì)胞比較，GATA-1基因表達(dá)水平在24h后降低，GATA-2基因表達(dá)水平無明顯改變，Ets-1基因表達(dá)水平在24h后出現(xiàn)升高。
　　(3)模擬微重力處理K562細(xì)胞后，F(xiàn)-actin、β-Tub

15、ulin和Vimentin的熒光強(qiáng)度較NG組均明顯減弱。
　　(4) SMG組細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的基因表達(dá)水平在12h和24h均較NG組減少，6h和48h無明顯改變。
　　(5)SMG組細(xì)胞骨架F-actin、β-Tubulin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平在12h和24h均較NG組減少。
　　研究結(jié)論：
　　模擬微重力可以抑制K562細(xì)胞紅系分化。其機(jī)制可能為模擬微重