魚類紅細胞和蝦類血淋巴細胞的免疫特性和抗菌機理研究.pdf

1、魚蝦類是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖動物。魚蝦類基礎(chǔ)免疫的研究，對開展其疾病的高效防控具有重要意義。紅細胞和血淋巴分別是魚類和蝦類氧氣運輸?shù)墓ぞ?，這些呼吸蛋白可以攜帶和運輸氧氣到生物體各個組織。魚類的呼吸蛋白是血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，蝦類的呼吸蛋白是血藍蛋白(hemocyanin，Hc)。除了呼吸作用之外，近年來魚類紅細胞和蝦類血淋巴細胞的免疫功能和抗感染活性越來越受重視。本研究以草魚、克氏原螯蝦和南美白對蝦三種重要經(jīng)濟養(yǎng)殖動

2、物為研究對象，對紅細胞、血淋巴細胞以及血藍蛋白在免疫功能和抗菌機理方面進行研究，主要結(jié)果如下:
　　1、草魚紅細胞對細菌的吞噬活性。將草魚紅細胞分別與FITC標(biāo)記后的嗜水氣單胞菌和金色葡萄球菌進行孵育，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紅細胞對兩種細菌都有粘附作用。掃描電鏡結(jié)果顯示，紅細胞不僅可以對細菌有粘附功能，也可以伸出絲狀偽足捕獲細菌。共聚焦、透射電鏡和掃描電鏡等結(jié)果顯示紅細胞對多種細菌有廣泛的吞噬活性。
　　2、草魚紅細胞的抗菌機

3、理。草魚紅細胞與嗜水氣單胞菌孵育時發(fā)現(xiàn)，細菌可以導(dǎo)致紅細胞溶血現(xiàn)象的發(fā)生，同時紅細胞通過釋放活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，對細菌表現(xiàn)出廣泛的殺傷作用。為了進一步探究其ROS的來源，我們發(fā)現(xiàn)紅細胞內(nèi)存在的NADPH酶并不參與紅細胞ROS的調(diào)控作用。血紅蛋白在空氣中快速自氧化并產(chǎn)生高水平的ROS和高價鐵離子。細菌來源的蛋白酶和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可以協(xié)同促進血紅蛋白的水解

4、，并促進ROS的釋放，并對細菌表現(xiàn)出很強的殺傷作用。
　　3、草魚巨噬細胞對血紅蛋白的清除機理。細菌感染導(dǎo)致紅細胞釋放出血紅蛋白，從而釋放ROS殺傷入侵的細菌，但是過多的ROS對機體也有毒性作用，因此機體需要對其進行清除。將草魚的血紅蛋白和紅細胞注射到草魚體內(nèi)后，伴隨著血清中血紅蛋白含量的升高，其抗氧化酶快速上調(diào)，表明血清可以清除多余的血紅蛋白。過多的血紅蛋白也可以造成頭腎的組織壞死，同時頭腎也參與了對血紅蛋白的清除。實驗表明頭腎

5、中的巨噬細胞可吞噬血紅蛋白，同時血紅蛋白釋放的ROS也可以促進巨噬細胞的細胞凋亡。為了進一步研究其機制，將50μg/ml和2mg/ml的血紅蛋白孵育巨噬細胞12h后，進行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，兩種劑量血紅蛋白的刺激，獲得的差異表達基因分別是2853個(1800個上調(diào)，1053個基因下調(diào))和3582個（2171個上調(diào)和1411個下調(diào)）。在這些差異表達中，分別有30和29個細胞因子基因，主要有趨化因子、炎癥因子等。通過qRT-PCR檢測確認(rèn)

6、了這些細胞因子表達和轉(zhuǎn)錄組基本一致。以上結(jié)果集中表明，巨噬細胞在清除血紅蛋白的同時，血紅蛋白也可以促進巨噬細胞凋亡和釋放細胞因子。
　　4、克氏原螯蝦血藍蛋白的抗菌機制。通過金色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦，血藍蛋白的mRNA水平顯著上調(diào)，說明血藍蛋白參與了細菌入侵的免疫應(yīng)答過程。通過原核表達獲得了全長血藍蛋白(PcHMC)及血藍蛋白的三個結(jié)構(gòu)域(rPcHMC1-T和rPcHMC1-C，rPcHMC1-N)。細菌結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)

7、PcHMC和三個結(jié)構(gòu)域都可以與細菌相結(jié)合;LPS結(jié)合試驗結(jié)果顯示PcHMC和三個結(jié)構(gòu)域可以與兩種細菌來源的LPS相結(jié)合;細菌凝集實驗結(jié)果表明，PcHMC和三個結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌毦饔糜胁町?。除了rPcHMC1-N外，PcHMC、rPcHMC1-T和rPcHMC1-C對金色葡萄球菌的抑制生長作用顯著;在副溶血弧菌生長實驗中，PcHMC和三個結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出了很強的抑菌效果;在酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活性測試中，rPcHM

8、C1-T釋放的PO活性顯著高于另外兩個結(jié)構(gòu)域;血細胞吞噬實驗中除了rPcHMC1-T外，PcHMC、rPcHMC1-N和rPcHMC1-C對金色葡萄球菌和副溶血弧菌都有顯著的促進血細胞吞噬的功能。上述結(jié)果表明，克氏原螯蝦的血藍蛋白具有結(jié)合、凝集和抑制細菌生長的活性，也可以通過釋放PO活性和促進血細胞的吞噬進行抗菌活性。血藍蛋白的三個不同結(jié)構(gòu)域在抗細菌活性中存在差異。
　　5、南美白對蝦血淋巴細胞抗副溶血弧菌感染的機制。將副溶血弧菌

9、和PBS注射到南美白對蝦體內(nèi)，12h后采集蝦的血細胞，進行轉(zhuǎn)錄組測定。一共獲得了2258個差異基因，其中1017個基因上調(diào)，1241個基因顯著下調(diào)。并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到5個可能直接參與免疫應(yīng)答的基因，分別是MNK1/2MAP激酶相互作用絲氨酸(MNK)，C型凝集素3(CTL3)，清道夫受體B1(SR)，γ-干擾素誘導(dǎo)型溶酶體巰基還原酶(GILT)和抗脂多糖因子樣蛋白(ALFP)。通過基因敲降方法對這5個基因進行進一步研究，結(jié)果表明它們