α-生育酚對鏈脲菌素誘導(dǎo)離體大鼠胰島β細(xì)胞損傷的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分：分離、培養(yǎng)的新生大鼠胰島β細(xì)胞形態(tài)及功能鑒定 目的：探討體外培養(yǎng)的新生大鼠胰島β細(xì)胞的功能狀態(tài)。 方法：采用膠原酶對1～3日齡Wistar大鼠胰腺組織進(jìn)行分次短時(shí)消化。倒置顯微鏡觀察接種18h細(xì)胞生長情況。繼續(xù)培養(yǎng)72h，雙硫腙(dithizone，DTZ)染色及胰島素免疫組化染色鑒定β細(xì)胞，放射免疫法檢測葡萄糖刺激下胰島素分泌水平。 結(jié)果：臺(tái)盼藍(lán)染色胰島細(xì)胞存活率＞90％，DTZ染色可染率＞80

2、％，細(xì)胞分泌功能正常。 結(jié)論：膠原酶分次短時(shí)消化胰腺組織，細(xì)胞接種后及時(shí)轉(zhuǎn)板的分離培養(yǎng)方法為本實(shí)驗(yàn)提供了純度較高、功能良好的胰島細(xì)胞。 第二部分：α-生育酚對鏈脲菌素誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損傷的干預(yù)效應(yīng) 目的：探討α-生育酚(α-tocopherol，α-T)對鏈脲菌素(strep-tozotocin，STZ)誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損傷的干預(yù)效應(yīng)。 方法：1.分組：分離1～3日齡wistar大鼠胰腺進(jìn)行體

3、外培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為4組：(1)對照組：培養(yǎng)的胰島細(xì)胞不作任何干預(yù)處理；(2)α-T組：培養(yǎng)液中僅加入終濃度為20rag/L α-T作用24h；(3)STZ組：培養(yǎng)液中僅加入終濃度為0.58mg/L的STZ作用30min；(4)干預(yù)組：培養(yǎng)液中加入終濃度為20mg/L α-T預(yù)處理24h后，再加入終濃度為0.58mg/L的STZ作用30min。各組作用時(shí)間一到，即離心棄上清液，用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)18h后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。2

4、.方法：采用MTT比色法檢測胰島細(xì)胞活性，放射免疫法檢測上清液中胰島素含量，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Hochest33258熒光染色觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：與對照組比較，STZ組胰島細(xì)胞活性、胰島素含量明顯降低，而胰島細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。同時(shí)，STZ組電鏡觀察到凋亡細(xì)胞，Hochest33258熒光染色發(fā)現(xiàn)發(fā)明亮淡藍(lán)色強(qiáng)熒光細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)。而在STZ作用前給予α-T預(yù)

5、處理的干預(yù)組，胰島細(xì)胞活性、胰島素含量及胰島細(xì)胞凋亡率雖未恢復(fù)到對照組水平，但其下降和上升的程度較STZ組出現(xiàn)明顯抑制(P＜0.05)。 結(jié)論：α-T能夠抑制STZ所致胰島β細(xì)胞凋亡而起到β細(xì)胞保護(hù)作用。 第三部分：α-生育酚對鏈脲菌素誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損傷的干預(yù)機(jī)理 目的：探討α-T對STZ誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損傷的干預(yù)機(jī)理。 方法：1.分組：同第二部分。 2.方法：采用分光光度計(jì)測量上

6、清液中總抗氧化能力(T-AOC)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平，一氧化氮合酶(NOS)活性、NO水平及胰島細(xì)胞特異性半胱氨酸酶-3(caspase-3)活性、特異性半胱氨酸酶-8(caspase-8)活性。免疫組化法測定胰島細(xì)胞bcl-x1、bax蛋白表達(dá)。 結(jié)果：與對照組比較，STZ組上清液中T-AOC水平、SOD活性明顯降低(p＜0.05)，MDA、NO水平顯著升高(p＜0.05)，而NOS活性無

7、顯著性改變(p＜0.05)。胰島細(xì)胞caspase-3活性、caspase-8活性、bax表達(dá)明顯升高(p＜0.05)，bcl-xl表達(dá)明顯降低(p＜0.05)。在STZ作用前給予α-T預(yù)處理的干預(yù)組，上述指標(biāo)的變化雖未恢復(fù)到對照組水平，但其下降和上升的程度較STZ組出現(xiàn)明顯抑制(p＜0.05)。 結(jié)論：α-T抑制STZ所致胰島β細(xì)胞凋亡的機(jī)制與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化，從而降低caspase-3、cas

8、pase-8、bax/bcl-xl比例有關(guān)。 第四部分：α-生育酚對鏈脲菌素誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損傷干預(yù)的劑-效關(guān)系 目的：探討α-T對STZ所致大鼠胰島β細(xì)胞損傷干預(yù)的劑-效關(guān)系。 方法：培養(yǎng)的胰島細(xì)胞分為4組：(1)對照組：培養(yǎng)的胰島細(xì)胞不作任何干預(yù)處理；(2)α-T組：培養(yǎng)液中僅加入終濃度為80mg/L α-T作用24h；(3)STZ組：培養(yǎng)液中僅加入終濃度為0.58mg/L的STZ作用30min；(4

9、)干預(yù)組：培養(yǎng)液中加入終濃度為5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L及80mg/L的α-T作用24h后，再加入終濃度為0.58mg/L的STZ作用30min。各組作用時(shí)間一到，即離心棄上清液，用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)18h后采用MTT法檢測胰島細(xì)胞活性、放射免疫法測定胰島素含量、分光光度計(jì)測量上清液中T-AOC水平。結(jié)果：與STZ組比較，不同濃度α-T(5～80mg/L)干預(yù)組中胰島細(xì)胞活性、胰島素分泌量及T-AOC