ERK1-2-Runx2信號通路介導周期性張應力作用下牙周膜成纖維細胞成骨分化的機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　正畸治療過程中，牙齒在正畸力的作用下發(fā)生移動，其生物學基礎在于牙周組織在應力刺激下發(fā)生改建。正畸力經(jīng)牙齒傳遞到牙周組織，牙周膜在這一過程中發(fā)揮了橋梁作用。牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜的主要構成細胞，在應力刺激下能合成細胞因子并通過胞內信號傳遞系統(tǒng)影響細胞行為（增殖，分化，凋亡等），從而介導牙周組織的改建，修復和再生。研究應力刺激在PDLF

2、胞內的信號轉導以及對PDLF行為的影響，對于闡明正畸力作用下牙周組織改建的分子機理，發(fā)現(xiàn)有利于促使牙齒移動的力學環(huán)境都具有重要意義。
　　成骨細胞是促進骨基質分泌和礦化的主要細胞。核心結合因子a1(corebinding factor a1，Cbfa1)，又稱Runt相關轉錄因子2(runt related transcription factor2，Runx2)，是學者們公認的最重要的成骨細胞特異性轉錄因子之一。Runx2蛋白能

3、特異性結合許多成骨基因啟動子上的順式作用元件，并促進成骨靶基因的轉錄表達。雖然Runx2基因和蛋白的表達水平在礦化組織和成骨細胞系中遠遠高于一些非骨組織來源的細胞，但是目前越來越多的研究表明其基因和蛋白水平與成骨細胞的功能和分化并不是直接線性相關，而Runx2蛋白的活化狀態(tài)也是其發(fā)揮功能的重要影響因素。目前，學者們一致認為Runx2是聯(lián)系胞外成骨誘導因素和胞內影響成骨細胞功能分化的信號通路的樞紐。
　　細胞外信號調節(jié)激酶1/2(e

4、xtracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)是最先被發(fā)現(xiàn)并且最具有代表性的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的成員。經(jīng)胞外刺激因素活化后的ERK1/2可以進一步影響其下游轉錄因子的表達和活化。有研究表明Runx2是ERK1/2眾多下游靶基因中的一員，但是ERK1/2-Runx2通路是否可以在應力刺激下的PDLF中被激活還

5、未知;如果其確實參與了應力刺激下PDLF的成骨分化，其具體的分子機理也有待深入研究。
　　本研究首先通過攜帶Runx2基因的慢病毒載體轉染原代培養(yǎng)的PDLF，探究Runx2對PDLF成骨分化的作用，然后構建了PDLF體外培養(yǎng)-應力刺激模型，觀察Runx2和其他相關成骨基因在應力刺激下的表達變化，以及ERK1/2通路在應力刺激下的激活情況;最后通過比較對正常PDLF和Runx2過表達PDLF實施應力刺激，以及特異性阻斷ERK1/2通

6、路對應力刺激PDLF成骨分化的影響，研究ERK1/2和Runx2在介導應力刺激促進PDLF成骨分化過程中發(fā)揮的作用，對應力刺激，ERK1/2，Runx2，以及PDLF的成骨基因表達這幾個因素之間的關系進行闡述，以明確ERK1/2-Runx2通路介導應力刺激調控PDLF成骨分化的分子機理，為臨床正畸矯治提供新的分子生物學基礎。
　　方法及結果：
　　1、牙周膜成纖維細胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用組織塊聯(lián)合酶消化法對牙周膜

7、成纖維細胞進行分離培養(yǎng)，并繪制細胞生長曲線。免疫細胞化學染色結果顯示角蛋白染色為陰性，波形絲蛋白染色為陽性，HE染色胞漿伊紅，胞核嗜堿性。成纖維細胞特異性表面蛋白1(FSP1)免疫熒光染色陽性。
　　2、穩(wěn)定過表達Runx2基因的PDLF的構建及Runx2對PDLF的成骨誘導作用
　　利用Ⅱ型Runx2基因以及LV5慢病毒載體構建LV5-Runx2慢病毒載體。有限稀釋法測定病毒液滴度為6x105TU/ml。通過靶細胞侵染預實

8、驗對MOI值以及Puromycin篩選濃度進行摸索，最終獲取穩(wěn)定過表達Ⅱ型Runx2的牙周膜成纖維細胞。熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉染LV5-Runx2的牙周膜成纖維細胞中Runx2的mRNA和蛋白水平都升高顯著。熒光定量PCR結果顯示Ⅱ型Runx2過表達可以有效促進PDLF中成骨轉錄因子SP7，骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的轉錄表達，但對1型膠原（COL-1）和堿性磷酸酶(ALP)的表達無影響，并且輕微

9、抑制轉錄激活因子4(ATF4)的表達。茜素紅染色實驗證實Ⅱ型Runx2過表達的PDLF體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結節(jié)。
　　3、周期性張應力刺激體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細胞模型構建
　　使用多通道細胞體外牽張應力加載系統(tǒng)，對體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細胞施加振幅10％，頻率0.5HZ的周期性牽張力，加力作用時間為1h，3h，6h，12h，18h，24h，以不加力組作為對照組，采用熒光定量PCR測定并繪制成骨基因Runx2，SP7，

10、OCN，BSP和ATF4的mRNA隨加力時間延長而變化的表達曲線;利用Western Blot和免疫沉淀法測定Runx2蛋白水平在不同加力時間點的表達，以及Runx2和ERK1/2在不同加力時間的激活情況。結果證實了周期性張應力可以促使牙周膜成纖維細胞中上述成骨基因的表達，并且在這一過程中同時伴隨Runx2和ERK1/2通路的磷酸化。
　　4、ERK1/2-Runx2通路介導了周期性張應力刺激下牙周膜成纖維細胞的成骨分化
　

11、　對正常PDLF和過表達Runx2的PDLF分別進行應力刺激3h，熒光定量PCR結果顯示周期性張應力刺激以及Runx2過表達對牙周膜成纖維細胞中成骨基因SP7，OCN和BSP的mRNA表達有協(xié)同促進作用，即對Runx2過表達的PDLF同時施加應力刺激比不加力的Runx2過表達PDLF或者加力的正常PDLF對上述成骨基因的轉錄刺激作用更強。對加力組PDLF同時應用ERK1/2通路的特異性抑制劑U0126后，上述成骨基因的轉錄表達水平較單純

12、加力組有所下降。通過對正常PDLF和過表達Runx2的PDLF中Runx2的mRNA和蛋白水平的測定，發(fā)現(xiàn)應力刺激都可以誘導Runx2基因的轉錄和翻譯，但ERK1/2通路被抑制后，Runx2的mRNA水平顯著下降，而蛋白水平無明顯變化，說明應力刺激對Runx2的轉錄表達可以通過ERK1/2介導，但ERK1/2對Runx2蛋白的翻譯過程影響不大。通過測定Runx2的蛋白磷酸化水平(p-Runx2)，發(fā)現(xiàn)p-Runx2的表達趨勢與上述成骨基

13、因的表達趨勢高度一致，從而推測ERK1/2-Runx2通路介導應力刺激對牙周膜成纖維細胞的成骨分化的機制在于提高Runx2蛋白表達水平的同時對其進行磷酸化修飾以提高Runx2蛋白的轉錄激活功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2蛋白主要存在于胞漿中，而Runx2蛋白則存在于胞核中;應力刺激激活ERK1/2后促使p-ERK1/2進入胞核并與Runx2形成蛋白復合體，推測這為p-ERK1/2對Runx2的磷酸化修飾提供了條件;U0126抑制了應力刺

14、激下ERK1/2的活化，從而阻止p-ERK1/2進入細胞核并激活Runx2。
　　結論：
　　1.Runx2對牙周膜成纖維細胞的成骨分化具有促進作用，可提高下游成骨靶基因SP7，OCN和BSP的轉錄水平的表達。
　　2.周期性張應力刺激可以促進牙周膜成纖維細胞成骨基因SP7，OCN和BSP的轉錄表達;Runx2基因的mRNA和蛋白表達水平也同時升高，并伴隨Runx2蛋白和ERK1/2通路的磷酸化。
　　3.ERK

15、1/2-Runx2通路介導周期性張應力刺激促進牙周膜成纖維細胞成骨分化的機制在于提高胞內Runx2蛋白的磷酸化水平(p-Runx2)，從而促進Runx2下游成骨基因的轉錄表達;Runx2總蛋白水平與下游成骨基因轉錄表達無相關性。應力刺激激活ERK1/2進入細胞核中與Runx2形成蛋白復合體，猜測這為p-ERK1/2對Runx2的磷酸化提供了條件;阻斷ERK1/2通路影響了應力刺激對ERK1/2的激活以及入核，從而影響了Runx2蛋白的磷

16、酸化修飾和成骨基因的轉錄表達。
　　創(chuàng)新和意義：
　　本課題從細胞分子水平證實了ERK1/2-Runx2通路參與了周期性張應力刺激下牙周膜成纖維細胞的成骨分化，并進一步探討了其具體的機制，認為Runx2的磷酸化水平的而非總蛋白水平在調控下游成骨靶基因轉錄表達方面起到至關重要的作用;而應力刺激下活化的ERK1/2則在轉錄水平提高Runx2的表達并同時進入細胞核與Runx2蛋白結合以促使Runx2蛋白的磷酸化。以上觀點為臨床正畸