IKCa1相關的miRNA對HeLa細胞增殖、遷移及侵襲作用機制初探.pdf

1、目的：1.探討中電導鈣激活鉀離子通道(IKCal)對HeLa細胞增殖、遷移及侵襲特性的影響;2.探究IKCal對miRNA表達譜的影響，篩選出與IKCal相關的miRNA，并通過生物信息學預測其靶基因，對其靶基因進行功能分析（GO分析），篩選出差異顯著的miRNA，，對其靶基因進行信號通路富集分析，初步探索IKCal相關miRNA與HeLa細胞增殖、侵襲及轉移的相關關系，為進一步探究miRNA在預防和治療宮頸癌的靶標分子中提供了線索。<

2、br>　　方法：1.分別設置濃度為0、10.0、20.0、30.0、40.0μmol/L TRAM-34（IKCal特異性阻斷劑）為觀察1-5組及等體積的DMSO組（TRAM-34溶劑）處理HeLa細胞24h、48h和72h，采用CCK8實驗檢測HeLa細胞增殖特性;采用劃痕實驗測量HeLa細胞實際遷移距離從而檢測HeLa細胞遷移特性;2.按上述6組分組處理HeLa細胞48小時后用Transwell實驗檢測其侵襲特性;3.通過本研究前期

3、預實驗、查閱相關文獻、結合CCK8實驗及劃痕實驗結果篩選0.0、30.0μmol/L TRAM-34分別處理HeLa細胞48小時作為對照組和實驗組，采用高通量測序方法檢測IKCal阻斷前、后miRNA表達譜的變化;4.采用qRT-PCR法對部分差異顯著表達miRNAs進行驗證，從而驗證高通量測序結果的準確性;5.運用miRanda、miRWalK、Targetscan、DIANAmT、miRDB等軟件預測篩選的差異顯著表達miRNA可能

4、調控的靶基因以及GO功能分析;再從表達譜中上調和下調的miRNA中各選一個與宮頸癌密切相關的miRNA作為研究對象即為靶miRNA，對其靶基因進行信號通路富集分析。
　　結果：1.CCK8實驗提示TRAM-34抑制HeLa細胞的增殖，在一定范圍內(nèi)，具有劑量依賴性，在培養(yǎng)細胞24h時DMSO組、觀察1組和觀察2組三組間差異均不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余各組與DMSO組及與觀察1組之間具有顯著性差異(p＜0.001);而培養(yǎng)

5、HeLa細胞48、72h后，DMSO與觀察1組間差異不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，而其余各觀察組與觀察1組、DMSO組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)，提示本實驗中MDSO濃度對HeLa細胞無影響;劃痕實驗提示TRAM-34能抑制HeLa細胞遷移，在一定范圍內(nèi)，具有時間及劑量依賴性，隨著濃度增加及作用時間延長，抑制遷移作用越明顯(p＜0.001))。2.Transwell侵襲實驗證明，在一定濃度范圍內(nèi)，HeLa細胞的侵襲率

6、隨TRAM-34濃度增加呈遞減趨勢(F=384.050，p＜0.001)。3.分析對照組與實驗組的miRNA高通量測序結果，通過對不同樣本的Clear data的比較，分析其共有序列及特有的序列，以Fold Change≧1.5，qvalue＜0.01為差異顯著表達的篩選標準，在871條差異表達中篩選出20個差異顯著表達的miRNAs，其中15個差異miRNA表達上調，5個差異miRNA表達下調。4.結合高通量測序結果及查閱相關文獻，在

7、15個表達上調的miRNA中挑選4個(hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P)和5個表達下調的miRNA中挑選1個(hsa-miR-421)進行qRT-PCR驗證，結果顯示hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3、hsa-miR-421表達量的變化趨勢與高通量測序的結果一致，在實驗組與對照組中差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0

8、.05)，從而檢測高通量測序結果的準確性;5.通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，差異顯著的miRNA的靶基因主要富集蛋白結合，細胞代謝過程、運輸過程等條目;其中hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。通過對hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421進一步行信號通路分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143--5P靶基因主要涉及到腫瘤蛋白多糖、p53信號通路、癌癥相關通路及MAPK信號通路等過程，其中在p