應激條件下抗凋亡蛋白HAX-1調節(jié)c-Abl活性及其生物學功能研究.pdf

1、HAX-1是一種抗凋亡蛋白，參與細胞遷移及細胞存活等過程調控，其編碼基因突變會導致重型先天性中性粒細胞減少癥（severe congenital neutropenia， SCN3，又叫Kostmann綜合征）及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。c-Abl非受體酪氨酸激酶參與氧化應激過程調控，可以調節(jié)細胞對氧化損傷的抵抗力。ROS（Reactive oxygen species）激活胞漿中的c-Abl，通過調節(jié)過氧化氫酶（Catatlase，CAT）、谷胱

2、甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）將H2O2降解，而在無法控制的H2O2水平時則啟動細胞凋亡機制。另外，過量的ROS會導致細胞內受損蛋白積累，蛋白酶體主要負責損傷蛋白的清除，而c-Abl可通過磷酸化蛋白酶體PSMA7亞基，進而影響蛋白酶體復合物的功能。前期研究發(fā)現(xiàn)HAX-1與c-Abl存在相互作用并且具有功能相關性。本研究旨在闡明HAX-1與c-Abl相互作用的生物學意義及分子機制，包括HAX-1的抗

3、凋亡機制、c-Abl非受體酪氨酸激酶的活性調節(jié)機制及其氧化應激下生物學功能的調控機制，為深入認識HAX-1相關疾病的發(fā)病機理提供新的重要理論依據(jù)。
　　在本研究中，首先通過免疫共沉淀、免疫印跡、in situ PLA等技術證實HAX-1和 c-Abl確實存在相互作用，并且在氧化應激（Oxidative stress）及離子輻射（ionizing radiation，IR）等條件下二者的結合水平顯著升高，表明二者在應激條件下發(fā)揮某種

4、共同作用。正常狀態(tài)下c-Abl活性很低，處于自抑制狀態(tài)，應激狀態(tài)下c-Abl被活化。通過特異性磷酸化抗體的Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，HAX-1的結合促進c-Abl蛋白的Y412位酪氨酸磷酸化水平，而412位酪氨酸的磷酸化水平代表了其活性狀態(tài)。在對細胞進行H2O2處理之后，HAX-1顯著增強氧化應激條件下H2O2對c-Abl的酪氨酸激酶的激活功能，表明HAX-1可以通過調節(jié)c-Abl活性來影響其生理功能如抗氧化損傷。
　　另一

5、方面，過度激活的c-Abl會啟動降解機制，而前期研究發(fā)現(xiàn)HAX-1降低c-Abl半衰期，可能是通過促進其蛋白酶體降解實現(xiàn)。為證實這一設想，我們在HEK293及MCF-7細胞系中分別檢測過表達及內源性c-Abl的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)外源過表達的HAX-1可以顯著增強c-Abl的泛素化水平；而將MCF-7細胞中的HAX-1進行RNAi之后，c-Abl的泛素化修飾幾乎檢測不到，說明HAX-1的確可以促進c-Abl的泛素化降解。我們知道，c-Cbl

6、是介導c-Abl泛素化的泛素連接酶（ubiquitin ligase，E3），通過一系列實驗我們證實HAX-1正是通過介導c-Abl與其E3 c-Cbl的結合來調節(jié)其泛素化修飾。
　　以上說明HAX-1對c-Abl的調控是雙面的：一方面HAX-1促進c-Abl在特殊條件下的活化，而當c-Abl過度激活時，HAX-1又會介導c-Abl與其E3結合，促進其泛素化降解，從而使得細胞內c-Abl的活性保持在一個合適水平，實現(xiàn)自我調控。

7、r>　　既然HAX-1與c-Abl在氧化應激條件下相互作用增強，并且顯著激活c-Abl的酪氨酸激酶活性，我們不難設想二者在抗氧化損傷方面行使某些共同的作用。我們首先構建 HAX-1 knockdown（ HAX-1 siRNA）、c-Abl/Arg knockdown（c-Abl/Arg siRNA）及c-Abl/Arg/HAX-1knockdown（c-Abl/Arg/HAX-1 siRNA）穩(wěn)定細胞系，利用流式細胞儀技術分析三種細胞

8、系中的ROS水平及細胞凋亡程度，發(fā)現(xiàn)三種細胞系中 ROS含量及凋亡率都升高至一個相似水平。當我們在HAX-1 siRNA細胞中回復表達 c-Abl后，ROS水平有明顯下降，而回復表達HAX-1于c-Abl/Arg/HAX-1 siRNA中ROS則無明顯差異。而且，c-Abl特異性抑制劑 STI571（Imatinib）處理之后，HAX-1的抑制對細胞凋亡水平無甚影響。以上表明，HAX-1的抗凋亡功能尤其是對抗氧化損傷導致的細胞凋亡功能依

9、賴于c-Abl酪氨酸激酶。
　　除了可通過磷酸化CAT、Gpx直接介導ROS降解之外，我們的工作發(fā)現(xiàn)c-Abl還可調節(jié)蛋白酶體的活性以清除氧化環(huán)境下細胞內積累的損傷蛋白。通過對c-Abl/Arg siRNA MCF-7及其野生型細胞內的蛋白酶體含量及活性分析后發(fā)現(xiàn)， ROS刺激后MCF-7細胞中蛋白酶體水平升高，而c-Abl KD之后蛋白酶體復合物水平并未受ROS影響。不僅如此，隨著H2O2濃度的升高，KD細胞內蛋白酶體的降解能力

10、持續(xù)降低（圖14C），可能與ROS導致的蛋白酶體失活有關，然而在野生型MCF-7細胞內卻不存在這種現(xiàn)象，可能是因為ROS刺激導致的蛋白酶體含量的增多抵消了這種不足，這表明，c-Abl激酶可以通過調節(jié)蛋白酶體復合物含量及其蛋白質降解能力來應對氧化應激環(huán)境。
　　HAX-1的遺傳性突變會導致SCN的發(fā)生，本研究發(fā)現(xiàn)，SCN相關的HAX-1突變體無法正常調節(jié)c-Abl，包括活性調節(jié)、表達水平調節(jié)及抗氧化損傷調節(jié)，表明HAX-1/c-Ab

11、l/ROS途徑可能與SCN的發(fā)生有關。通過進一步研究，我們證實c-Abl特異性激活劑DPH可以保護MCF-7、SH-SY5Y和體外培養(yǎng)的中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）免受HAX-1缺失引起的氧化損傷。以上說明HAX-1突變導致的SCN是由于c-Abl活性失調導致的PMN氧化損傷引起的。臨床研究發(fā)現(xiàn)，c-Abl抑制劑類藥物在治療 CML時常伴有中性粒細胞減少癥副作用的發(fā)生。事實上，c-Ab

12、l特異性抑制劑Nilotinib確實可以造成誘導分化的類中性粒細胞（PMN-like）和小鼠體內的PMN氧化損傷，而抗氧化劑GSH（glutathione）則可以保護這些細胞。c-Abl激活劑DPH同GSH一樣，可以緩解HAX-1缺失導致的PMN-like氧化損傷并且可以延長氧化應激環(huán)境下體外培養(yǎng)的PMN的生存壽命。這個結果進一步印證了上述結論，并且為治療或緩解SCN及 CML病人的副作用提供了一個重要的理論研究基礎，即利用 GSH等抗