甲基蓮心堿對糖尿病血管內皮細胞和交感神經節(jié)損傷的作用及機理研究.pdf

1、背景：糖尿病是危害人類健康的四大疾病之一，目前我國是世界上糖尿病發(fā)病人數(shù)最多的國家。糖尿病嚴重影響著人民健康和社會發(fā)展，對糖尿病的防治已成為醫(yī)學科學工作者的一個重要課題。糖尿病的主要危害不是糖尿病本身，而是在糖尿病發(fā)展過程中出現(xiàn)的各種慢性并發(fā)癥。糖尿病引發(fā)的交感神經和心血管損傷并發(fā)癥嚴重影響患者的生活質量，是致殘、致死的重要原因。血管內皮細胞是具有血管調節(jié)功能和分泌作用的重要器官。頸上交感神經節(jié)的節(jié)后神經纖維可分布至心神經叢，影響心臟和

2、血管的活動。研究報道蓮籽芯具有降血糖作用。甲基蓮心堿(neferine，Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽(蓮籽芯)中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿。本實驗研究探索甲基蓮心堿在糖尿病及其并發(fā)交感神經和心血管損傷中的作用及其可能作用的新靶點，并為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的實驗依據。
　　 目的：⑴通過觀察高糖致血管內皮細胞基因表達變化及甲基蓮心堿的影響，了解甲基蓮心堿對高糖致血管內皮細胞損傷的保護作用及可能機理；⑵幾乎

3、全部與人類疾病有關的基因與大鼠基因有同源性。實驗觀察甲基蓮心堿對2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰島素及血壓影響的同時，了解甲基蓮心堿對糖尿病模型大鼠頸上交感神經節(jié)CCL5及CCR5表達的影響，探討糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制及甲基蓮心堿的作用機理；⑶應用差異蛋白質組學方法觀察糖尿病模型大鼠頸上交感神經節(jié)相關蛋白質分子的變化，篩選藥效作用靶點，揭示甲基蓮心堿防治糖尿病并發(fā)癥的作用機理，為臨床推廣應用提供實驗依據。
　　 方法：①以

4、高濃度(44mM)的葡萄糖作用于原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)共孵育5天誘導模擬糖尿病內皮細胞損傷。應用硝酸還原酶法檢測細胞上清液中一氧化氮(NO)的含量；熒光法測定細胞內活性氧(ROS)水平；美國Superarray RT2 ProfilerTM PCR基因表達譜芯片進行多基因分析；通過免疫組織化學、原位雜交、RT-PCR和蛋白印跡分析從內皮細胞基因表達譜中篩選出的和糖尿病并發(fā)癥有重要相關性的趨化因子5(CCL5)及其受體C

5、CR5 mRNA和蛋白表達變化，并觀察甲基蓮心堿對其影響。②選用雄性SD大鼠，通過高糖高脂飲食加腹腔小劑量注射鏈脈佐菌素復制糖尿病大鼠模型，運用生化、放免、血壓測定、雙向電泳、免疫組織化學、原位雜交、RT-PCR和蛋白印跡等檢測手段和方法，觀察甲基蓮心堿對糖尿病大鼠體重、空腹血糖、血脂、血胰島素、血壓及頸上神經節(jié)和心肌組織CCL5及其受體CCR5 mRNA和蛋白表達的影響。③通過差異蛋白質組學技術篩選出糖尿病大鼠模型頸上交感神經節(jié)相關蛋

6、白質的變化并觀察甲基蓮心堿的作用，并將其中與糖尿病并發(fā)癥有重要相關性的二甲基精氨酸氨基水解酶1(DDAH1)和泛素羧端水解酶L1(UCHL1)蛋白進一步應用蛋白印跡方法檢測，確定甲基蓮心堿對神經節(jié)DDAH1和UCHL1表達的影響。
　　 結果：⑴高糖孵育HUVEC細胞5天后，細胞培養(yǎng)上清液中NO含量顯著性減少，細胞內ROS水平明顯升高；高糖同時使用甲基蓮心堿能顯著性增加高糖所致NO含量的減少，降低高糖所致ROS水平的升高。PCR

7、芯片結果發(fā)現(xiàn)慢性高糖處理后有16個基因上調，10個基因下調，其中變化最大的是與內皮細胞活性和內皮細胞損傷有關的CCL5。RT-PCR證實高糖培養(yǎng)細胞CCL5和CCR5mRNA增加，甲基蓮心堿能糾正高糖引起的CCL5和CCR5 mRNA的表達上調。蛋白印跡結果發(fā)現(xiàn)慢性高糖引起CCL5和CCR5蛋白表達上調，甲基蓮心堿能顯著降低高糖所致的CCL5和CCR5蛋白表達的上調。⑵甲基蓮心堿處理后使2型糖尿病模型大鼠體重增加，血壓降低，心率減慢，空

8、腹血糖、血胰島素、總膽固醇、甘油三酯降低，高密度脂蛋白升高，即甲基蓮心堿具有較好的改善糖尿病大鼠胰島素抵抗和調整脂代謝紊亂作用。RT-PCR和原位雜交結果顯示糖尿病大鼠頸上神經節(jié)和心肌組織中CCL5和CCR5 mRNA的表達上調，甲基蓮心堿能降低CCL5和CCR5 mRNA的表達上調。免疫組織化學和蛋白印跡結果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠頸上神經節(jié)和心肌組織中CCL5和CCR5蛋白的表達增加，甲基蓮心堿可降低CCL5和CCR5蛋白的增加表達。⑶差異蛋

9、白質組學技術分離、鑒定糖尿病大鼠頸上神經節(jié)差異蛋白結果顯示：差異表達的23個蛋白質斑點經鑒定后，歸為17種蛋白，這17種蛋白按功能分為細胞骨架、能量代謝、信號傳導、NO生成調節(jié)、氧化應激和炎癥反應六大類。糖尿病模型大鼠頸上交感神經節(jié)大部分蛋白表達量均不同程度下調，只有NADH脫氫酶表達量上調。甲基蓮心堿能糾正糖尿病大鼠大部分改變的蛋白表達量。二維電泳及蛋白印跡檢測結果證實糖尿病大鼠頸上神經節(jié)和心肌組織DDAH1和UCHL1表達降低。DD