鹽酸小檗堿對大鼠非酒精性脂肪肝的作用及機制探討.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的以肝細胞內(nèi)脂肪堆積為主要特征的臨床病理綜合征。目前發(fā)現(xiàn)肥胖，2型糖尿病，高脂血癥等因素單獨或共同構(gòu)成了NAFLD的易感因素。近年來隨著人們生活水平的不斷提高，NAFLD以高發(fā)病率，低齡化趨勢日益受到人們的重視。目前已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題和社會問題。然而對于NAFLD的發(fā)病機制尚無明確闡述，有研究發(fā)現(xiàn)

2、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，脂質(zhì)代謝紊亂，炎性因子及內(nèi)毒素等在其發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。但目前對其尚無確切的有效治療藥物。鹽酸小檗堿(Berberine hydrochloride，BBR)即黃連素，作為治療腸道感染性疾病的藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對降低血糖，改善IR；調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常等作用。并且其具有藥源廣泛，價格低廉，副作用小等優(yōu)點。所以本實驗通過高脂喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型，并應(yīng)用BBR對其進行干預(yù)治療

3、，以探討B(tài)BR對大鼠NAFLD的治療效果及其可能的作用機制。為今后BBR在脂肪肝及降糖、降脂等作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　高脂飲食建立NAFLD模型，給予BBR干預(yù)治療。觀察BBR對大鼠模型體重、肝指數(shù)、肝功能、血脂、IR指數(shù)、TNF-α以及對肝臟病理學(xué)變化的影響。并探討鹽酸小檗堿防治NAFLD的作用機制。
　　方法：
　　1.將36只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為以下2組：正常組(n=10)和高脂造模

4、組(n=26)。兩組大鼠自由飲水進食，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)(84％普通飼料+10％豬油+5％蛋黃粉+1％膽固醇)。連續(xù)喂養(yǎng)12周，每周定時稱量大鼠體重1次。所有大鼠均在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科動物實驗室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為25±2℃、明暗各12h。大鼠喂養(yǎng)12周末，正常組及高脂組各隨機取2只大鼠處死，取肝組織，常規(guī)行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，確認大鼠脂肪肝造模成功。
　　2.造模成功后將高

5、脂造模組大鼠再隨機分為模型組(n=8)、BBR小劑量組(n=8)、BBR大劑量組(n=8)。BBR應(yīng)用蒸餾水充分混懸，BBR大、小劑量組分別給予BBR300mg/(kg·d)和150mg/(kg·d)灌胃，并繼續(xù)給予高脂飲食。同時正常組和模型組大鼠均給予等體積蒸餾水灌胃。灌胃時間為每日上午9:00-10:00。持續(xù)灌胃4周，于4周末統(tǒng)一處死大鼠，處死前一晚禁食水12小時。
　　3.觀察大鼠毛發(fā)和行為情況，電子天平稱取大鼠體重、肝濕

6、重，并計算肝指數(shù)=(旰濕重/體重×100％))。各組動物經(jīng)10％水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，無菌無致熱源條件下于下腔靜脈采血5ml，將血液置于離心機內(nèi)，3000r/min離心15分鐘，分離血清用于：
　　(1)鱟試劑法測定血清內(nèi)毒素水平。
　　(2)放射免疫法測定空腹血清胰島素(FINS)含量，并計算穩(wěn)態(tài)模式評估法胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=((FPG×FINS)/22.5。
　　(3)采用全自動

7、生化分析儀測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(FPG)等各項生化指標。
　　4.取肝左葉約1cm×1cm×0.5cm肝組織固定于4％甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，HE染色用以觀察肝臟病理變化。取1g肝組織放于EP管中，低溫冰箱保存，用于制備肝組織勻漿，采用Western Blot方法測定肝組織TNF-α含量。
　　結(jié)果：
　　1.

8、各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)的變化情況：12周末行HE染色，確定NAFLD大鼠造模成功。16周末模型組大鼠體重(570.9±13.4)、肝濕重(19.82±2.47)，并計算出肝指數(shù)(3.48±0.46％)均明顯高于正常對照組的體重(507.4±11.7)、肝濕重(12.91±0.78)及肝指數(shù)(2.55±0.16％)(均P<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，BBR大劑量組體重(517.2±14.7)、肝濕重(13.30±0.62

9、)、肝指數(shù)(2.55±0.14％)；BBR小劑量組體重(522.2±18.9)、肝濕重(13.76±0.69)、肝指數(shù)(2.61±0.10％)均明顯降低(均P<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.肝功能和血脂指標：(1)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)：模型組ALT(67.88±8.68)較正常組(41.63±6.48)顯著增高(P<0.01)，而BBR大、小劑量組ALT分別為(42.38±3.78)和(39.25±

10、4.43)較模型組顯著下降(均P<0.01)。模型組AST為(215.88±12.99)較正常組(157.80±17.72)顯著增高(P<0.01)，而BBR大、小劑量組AST分別為(159.63±8.05)和(163.88±7.14)，較模型組明顯下降(均P<0.01)。
　　(2)血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL)：模型組血清TG、LDL分別為(0.65±0.07，0.45±0.0

11、4)較正常組(0.34±0.05，0.16±0.04)顯著升高(均P<0.01)，BBR大、小劑量組TG和LDL分別為(0.36±0.06，0.24±0.03)和(0.38±0.05，0.22±0.03)較模型組明顯下降(均P<0.01)；模型組HDL(0.65±0.06)較正常組(0.82±0.08)顯著下降(P<0.01)，而BBR大、小劑量組HDL分別為(0.85±0.05)和(0.81±0.06)，較模型組明顯上升(均P<0.0

12、1)。
　　3.IR及血糖的情況：空腹血糖(FPG)、胰島素(FINS)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)在模型組(9.7±0.6，12.31±0.76，5.32±0.59)明顯高于正常對照組(4.7±0.5，8.53±0.58，1.79±0.30，(均P<0.01)，分別應(yīng)用BBR大劑量(5.8±0.4，9.67±0.63，2.51±0.30)和小劑量(5.9±0.6，9.52±0.65，2.49±0.39)干預(yù)后，上述三種指標

13、均較模型組明顯下降(均P<0.01)。
　　4.血清內(nèi)毒素水平
　　與正常組大鼠血清內(nèi)毒素(0.12±0.01)相比，模型組大鼠血清內(nèi)毒素水平(0.24±0.02)明顯升高(P<0.01)，給予藥物小檗堿BBR干預(yù)后，BBR大、小劑量組大鼠血清內(nèi)毒素水平分別降低至(0.14±0.01)、(0.17±0.01)與模型組相比明顯降低(均P<0.01)，并且大劑量組內(nèi)毒素水平比小劑量組降低更顯著(P<0.05)。
　　5.肝

14、組織病理學(xué)變化：肉眼觀：正常組大鼠肝臟邊緣銳利，表面光滑，呈鮮紅色。高脂模型組大鼠肝臟外觀呈彌漫性腫大，邊緣鈍而厚，表面顏色呈土黃色，切面油膩，與周圍組織有粘連。
　　光鏡下HE染色顯示：正常組大鼠肝細胞無脂肪變性，均無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞索排列松散，肝細胞腫脹，均出現(xiàn)了大泡性肝細胞脂肪變性，以中央靜脈周圍最為明顯，肝細胞脂肪變性面積達到2/3以上，部分視野見炎性細胞浸潤和輕度的肝細胞壞死。BBR治療組大鼠的肝臟脂肪變性

15、情況較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，肝細胞排列整齊，形態(tài)接近正常。
　　6.肝組織TNF-a含量
　　高脂模型組大鼠肝組織TNF-a表達含量(1.44±0.08)較正常組大鼠(0.96±0.05)明顯增高(P<0.01)，給予藥物小檗堿干預(yù)后大、小劑量肝組織TNF-a表達含量明顯下降(0.82±0.05)、(0.98±0.06)(P均<0.01)。并且大劑量組降低更明顯。
　　結(jié)論：
　　高脂飼料飲食12周即可成功復(fù)制大鼠N