抗草甘膦轉基因大豆生物測定方法的研究.pdf

1、轉基因大豆的種植,極大地提高了農田除草效率,取得了巨大的經濟效益和社會效益。但是隨著研究的不斷深入,轉基因大豆的生態(tài)安全性、抗性基因的流向和由此引發(fā)的食品安全性問題則引起了越來越多的爭議,甚至在一定程度上阻礙了轉基因技術的發(fā)展。因此,建立完善的轉基因大豆檢測方法對于我國的大豆育種研究、環(huán)境安全性和食品安全性等有重要的意義。
　　 目前關于抗草甘膦轉基因大豆的檢測方法主要集中在分子檢測法和田間(溫室)整株鑒定法。前者由于儀器、試劑

2、要求精確,成本較高,專一性強,且只是針對靶標基因進行檢測,并不能驗證靶標基因的表達與否;后者雖然直觀準確,但所需時間比較長、工作量大,且易受季節(jié)影響。
　　 本研究針對目前的的研究現狀,利用除草劑生物測定技術,構建了抗草甘膦轉基因大豆生物生化測定方法;并且對檢測指標、該方法適用的不同培養(yǎng)條件、溫度等進行了深入的研究,同時輔以田間表型鑒定和分子檢測手段對方法進行了驗證。
　　 主要研究結果如下:
　　 一、抗草甘膦

3、轉基因大豆生物測定方法的建立
　　 1、在26℃、持續(xù)黑暗培養(yǎng)72h,以大豆萌發(fā)過程中草甘膦對下胚軸抑制率為檢測指標,建立了檢測轉基因大豆的生物測定方法。研究結果表明:轉基因大豆下胚軸抑制中濃度為1620.86-2269.33mga.I./L;非轉基因大豆的下胚軸抑制中濃度為78.04-97.43ma.I./L,二者有顯著性差異。因此,為方便快速,在各自95％置信區(qū)間內.確定快速甄別劑量為100mga.I./L,或者2000mg

4、a.I./L,在此甄別劑量下可以有效區(qū)分轉基因大豆和非轉基因大豆。
　　 2、依據生物測定的方法,建立了以莽草酸積累量為指標的生物化學檢測方法:即在100mga.I.L(非轉基因大豆的抑制中濃度)下,非轉基因大豆的莽草酸積累量約為1237.7ug/gFW,轉基因大豆的莽草酸積累量只有64.61ug/gFW,二者之間有顯著性差異,可以有效地鑒別轉基因大豆和非轉基因大豆。
　　 3、利用生物和生化測定方法,對樣本龍抗630、

5、綏10-6047進行了檢測。結果表明:龍抗630和綏10-6047為轉基因大豆,確定EPSPS基因已經成功轉入大豆體內。并且獲得表達。田間表型鑒定表明龍抗630、綏10-6047為高抗草甘膦大豆,同時分子檢測結果表明兩份大豆為陽性。三種檢測結果相互印證,證明生物生化測定方法可行。
　　 二、室內生物測定方法建立的生理生化機理研究
　　 1、受到草甘膦脅迫時,莽草酸途徑是主要的靶標途徑。轉基因大豆因其轉入了EPSPS基因,

6、表現了此生理途徑不受影響,莽草酸的積累量較小,從而能夠在較高濃度的草甘膦水培條件下正常的萌發(fā)生長,而非轉基因大豆則沒有此能力。
　　 2、受到草甘膦脅迫時,轉基因大豆和非轉基因大豆的GSTS活性有顯著性差異,表明GSTS參與了大豆體內的解毒代謝作用,是大豆產生抗性的“解毒代謝層次”的重要原因。后期隨著濃度的增加和時間的延長活性逐漸減弱表明其解毒代謝能力是有限的。3、在抵抗草甘膦的脅迫過程中,轉基因大豆和非轉基因大豆體內SOD、P

7、OD活性雖然在最初有上升,但二者之間并無顯著性差異,表明這種機制其并不是抗性產生主要原因?？赡苁怯捎诖蠖故艿健俺輨┠婢澈退帜婢场钡拿{迫而誘發(fā)了自由基和活性氧等有害物質的產生,進而引起了SOD、POD活性的增加,是一種本能自衛(wèi)反映,起到一個協同抗性的作用。三、檢測方法的在雜交育種中的應用運用生物測定方法較為快捷的檢測了7個雜交后代品系,結果表明其大豆品種抗性程度明顯比雜交親本提高20-30倍,鑒定為轉基因抗草甘膦大豆,表明EPSPS基