Wip1基因敲除對急性肝損傷的影響及其機制研究.pdf

1、背景:肝臟作為人體內(nèi)最大的器官，構成體重的2.5％。肝臟的血液供應占全部血液循環(huán)的25％，分別通過門靜脈和肝動脈流入肝門，其中前者貢獻了肝臟全部血供的75-80％和全部氧供的＞50％。熱缺血再灌注損傷是臨床中非常常見的急性肝損傷，肝臟手術中經(jīng)常應用的Pringle manoeuvre是造成熱缺血再灌注損傷的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)，肝臟缺血再灌注損傷受到眾多調(diào)控機制的共同作用，包括血竇內(nèi)皮細胞和NO共同介導的血竇內(nèi)壓力改變[1]、Kupf

2、fer細胞介導的固有免疫反應[2，3]以及ATP耗竭介導的肝細胞壞死和caspase介導的細胞凋亡等。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在調(diào)控細胞凋亡、自噬、生長和再生及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt激活的下游凋亡和自噬通路調(diào)控肝臟缺血再灌注[8]，同時也有研究發(fā)現(xiàn)Rapamycin抑制mTORC1功能從而激活mTORC2-Akt通路從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。Wip1（Wild-type p53 induc

3、ed phosphatase1）是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，研究發(fā)現(xiàn)其在機體免疫調(diào)控看、炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮作用，但目前尚無研究報道Wip1在肝臟缺血再灌注過程中的作用。本研究利用2/3肝臟熱缺血再灌注模型研究wip1基因在急性肝損傷中的作用，并初步探索Wip1對于肝臟缺血再灌注影響的機制。
　　方法:
　　1.將129sv背景的wip1基因敲除小鼠和C57BL/6背景的野生型小鼠進行雜交，以獲得C57BL/6純合背景的wip

4、1基因雜合小鼠，并進一步獲得wip1基因敲除小鼠。
　　2.10～14周齡wip1基因敲除小鼠作為實驗組小鼠，同窩同性別小鼠作為對照組小鼠，建立2/3肝臟熱缺血再灌注模型，缺血時間為60min、90min，術后6h、24h提取小鼠血液和肝臟，測血清ALT水平，H&E染色觀察組織學改變，TUNEL染色統(tǒng)計細胞凋亡率，Western Blot檢測肝組織Wip1、Akt、mTOR、p70 S6K、S6蛋白及相應磷酸化水平的改變，RT&R

5、eal-time PCR檢測肝組織wip1基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。
　　結(jié)果:
　　1.缺血60min，再灌注6h后，小鼠血清ALT水平分別為:野生型小鼠1172.5±237.1U/L，wip1-/-小鼠851.3±270.9U/L（P＜0.01）;假手術組小鼠ALT水平分別為:野生型小鼠44.3±11.3U/L，wip1-/-小鼠56.6±12.9U/L（P=0.369）。與同窩對照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠肝臟損傷

6、輕。
　　2.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝組織石蠟切片H&E染色結(jié)果為:野生型小鼠Suzuki評分為7.75±0.43，wip1-/-小鼠為5.25±0.43(P＜0.01)。與同窩對照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠組織病理學改變輕。
　　3.缺血90min，再灌注24h后，小鼠肝組織石蠟切片TUNEL染色結(jié)果為:野生型小鼠凋亡率約為62.3％±5.6％，wip1-/-小鼠約為30.4％±3.7％(P＜0.0

7、1)。與同窩對照野生型小鼠相比，wip1基因敲除小鼠凋亡率低。
　　4.缺血90min，再灌注6h后，野生型小鼠肝組織Wip1蛋白表達量有所下降;與同窩對照野生型小鼠相比，wip1-/-小鼠肝組織mTOR、phospho-mTOR(Ser2448)、Akt、S6蛋白水平無顯著差異，phospho-Akt(Ser473)、phospho-p70S6K(Thr389)蛋白水平明顯升高，phospho-S6(Ser235/236)蛋白水