真核原核表達UHRF2各結(jié)構(gòu)域突變體蛋白.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建UHRF2不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體表達載體并在真核細胞中表達；構(gòu)建UHRF2各個以結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的突變體原核表達載體，在大腸桿菌中表達并對融合蛋白進行純化和鑒定；為進一步研究UHRF2與其它蛋白相互作用位點奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　真核表達產(chǎn)物采用缺失體構(gòu)建策略，根據(jù)UHRF2不同結(jié)構(gòu)域位置特征，單個結(jié)構(gòu)域逐一缺失和兩個結(jié)構(gòu)域同時缺失，構(gòu)建5種不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體；以重組質(zhì)粒pCMV-3xFlag-UHRF

2、2為模板，PCR法直接擴增獲得△UBL、△RING和△YDG+△RING編碼基因，重疊PCR法擴增獲得△=PHD和△YDG編碼基因；雙酶切目的基因片段，定向克隆至pCMV-3xFlag真核表達載體中，構(gòu)建相應(yīng)重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，雙酶切及測序鑒定陽性質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染HEK293細胞，Western blot鑒定產(chǎn)物表達情況。
　　原核表達UHRF2的各個結(jié)構(gòu)域蛋白，采用直接GST融合各個結(jié)構(gòu)域的策略。以pCMV-3x

3、Flag-UHRF2為模板，PCR擴增UHRF2的各個結(jié)構(gòu)域，各PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接到pGEX-4T-1載體上。用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21菌株)，IPTG誘導(dǎo)下表達GST融合蛋白，超聲破碎細菌，離心收獲蛋白并經(jīng)Glutathione Sepharose4B球珠親合純化。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后用考馬斯亮藍染色或免疫印記實驗鑒定各蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　真核構(gòu)建的各個缺失體載體經(jīng)酶切和測序確認，

4、載體構(gòu)建正確；各重組載體在轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，經(jīng)免疫印記檢測顯示UHRF2的各個結(jié)構(gòu)缺失體成功表達。原核構(gòu)建的各個結(jié)構(gòu)域融合蛋白表達載體經(jīng)酶切和測序確認，載體構(gòu)建正確；各重組載體經(jīng)大腸桿菌BL21菌株表達，純化的蛋白經(jīng)蛋白電泳后考馬斯亮藍染色或免疫印記分析后顯示各融合蛋白成功表達。
　　結(jié)論：
　　UHRF2各結(jié)構(gòu)域缺失體的真核表達載體構(gòu)建成功便于細胞內(nèi)研究UHRF2各個結(jié)構(gòu)域的功能、UHRF2與其它蛋白在真核細胞內(nèi)相互