十字花科黑腐病菌小RNA鑒定及表達(dá)分析.pdf

1、細(xì)菌小RNA(smallRNAs，sRNAs)不同于傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的tRNA、mRNA和rRNA，是一類主要位于基因間區(qū)，長(zhǎng)度介于50-500nt之間，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子執(zhí)行多種功能的RNA分子。這類RNA分子廣泛分布于各種細(xì)菌中，通過(guò)堿基互補(bǔ)的形式與靶標(biāo)mRNA結(jié)合而調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和（或）翻譯，并因此影響細(xì)菌的環(huán)境應(yīng)答、毒力調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)。目前，細(xì)菌小RNA的鑒定和功能研究已受到廣泛關(guān)注，但系統(tǒng)鑒定的較少，特別是在植物病原菌中。本研究

2、運(yùn)用直接測(cè)序法對(duì)植物病原菌十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，簡(jiǎn)稱Xcc)8004菌株的小RNA進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，并在不同條件檢驗(yàn)了小RNA的表達(dá)情況。
　　 首先，我們將Xcc8004和8004△hrpG在MMX培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用酸酚法提取總RNA，直接送去華大基因公司進(jìn)行Solexa測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，我們對(duì)Xcc8004和8004△hrpG50-500nt的RNA

3、進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析。結(jié)果顯示：Xcc8004的Solexareads數(shù)為10105194，其中1396247(13.8％)對(duì)上基因區(qū)，8708947(86.2％)對(duì)上基因間區(qū)；8004△hrpG的Solexareads數(shù)為12471847，其中1581015(12.7％)對(duì)上基因區(qū)，10890832(87.3％)對(duì)上基因間區(qū)。我們從獲得的轉(zhuǎn)錄譜篩選出大量的候選小RNA，并依次進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 本研究從所有候選小RNA中選出5個(gè)進(jìn)行

4、northern雜交驗(yàn)證，結(jié)果顯示，有兩個(gè)候選小RNA出現(xiàn)清晰的大小位于100-200nt之間的雜交主帶，與轉(zhuǎn)錄譜的長(zhǎng)度吻合，證明這兩個(gè)是真正的小RNA，命名為sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6。接著，我們運(yùn)用在線軟件sFold和sRNATarget對(duì)sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)的預(yù)測(cè)，共獲得329個(gè)sRNA-Xcc5的候選靶標(biāo)，其中有25個(gè)是已知的致病基因；900個(gè)sRNA-Xcc6的候選靶標(biāo)，有62個(gè)

5、是已知的致病基因，表明sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6可能與Xcc的致病性相關(guān)。
　　 為了檢測(cè)sR.NA-Xcc5和sRNA-Xcc6在不同條件下的表達(dá)，我們?cè)诓煌囵B(yǎng)條件、不同pH脅迫、不同生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，8004WT和DM2515中小RNA在不同的NYG、XVM2和MMX的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，sRNA-Xcc5只在MMX培養(yǎng)時(shí)表達(dá)，在NYG、XVM2培養(yǎng)時(shí)不表達(dá)；sRNA-Xcc6在各種培養(yǎng)基中均

6、表達(dá)，但在MMX中表達(dá)量最高，說(shuō)明sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達(dá)受培養(yǎng)條件的影響，且在此條件下，hfq蛋白不參與兩個(gè)小RNA的表達(dá)。在不同pH脅迫的條件下，pH=5.5時(shí)sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達(dá)豐度最大；在pH=6.5時(shí)，兩個(gè)小RNA均表達(dá)，但表達(dá)豐度比正常值(pH=6.0)時(shí)低；pH=8.5時(shí)，sRNA-Xcc5不表達(dá)，sRNA-Xcc6仍能表達(dá)，但豐度低于正常值。在不同生長(zhǎng)時(shí)期，sRNA-Xcc5和

7、sRNA-Xcc6在8004野生型、hfq蛋白缺失時(shí)及hrpG缺失時(shí)均能表達(dá)，且表達(dá)差異不大，說(shuō)明在此條件下sRNA-Xcc5和sRNA-Xcc6的表達(dá)不受生長(zhǎng)時(shí)期的影響，不依賴于hfq蛋白，且不受hrpG的調(diào)控，與Xcc的三型分泌系統(tǒng)關(guān)聯(lián)性不大。
　　 綜上所述，我們用Solexa測(cè)序?qū)cc8004的小RNA進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，率先獲得兩個(gè)小RNA，并對(duì)這兩個(gè)小RNA在不同條件下的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，為在全基因組范圍內(nèi)鑒定Xcc80