棉花抗黃萎病相關基因GbSTK和GhGST的遺傳轉化與表達研究.pdf

1、課題組在前期研究工作中分別從抗黃萎病品種海島棉Pima90-53和陸地棉冀棉20中克隆得到抗黃萎病相關基因GbSTK(絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶基因)和GhGST(谷胱甘肽S-轉移酶基因),構建了基因超表達載體pGN-GbSTK和pBI121-GhGST,并在擬南芥和煙草上初步驗證了基因的功能。在此基礎上,本研究采用Realtime-PCR技術,分析不同抗病棉花品種在黃萎病菌誘導前后基因的表達差異及黃萎病菌脅迫下T3代轉基因擬南芥中GbSTK

2、的表達變化;采用農桿菌介導法和花粉管通道法轉化棉花,以獲得轉基因棉花植株。主要研究結果如下:
　　 1.Realtime-PCR結果顯示,GbSTK與GhGST在不同抗性棉花品種中的表達變化具有明顯差異,在抗病品種Pima90-53中基因的表達變化最大,次之是抗病品種冀棉20,在感病品種邯208中的表達變化最小,說明GbSTK和GhGST參與了黃萎病抗性反應。
　　 2.Realtime-PCR結果顯示,在黃萎病菌誘導下

3、,GbSTK在T3代轉pCamGbSTK:GFP擬南芥中的表達有明顯變化,在接菌后24h表達量最高,約為Oh的4倍,而野生型擬南芥中未檢測到GbSTK的表達。說明GbSTK參與了轉基因擬南芥的抗黃萎病反應。
　　 3.以陸地棉邯208為材料,研究固化劑、植物生長調節(jié)劑和抗生素篩選對莖尖生根和成苗的作用,以及菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間對轉化率的影響。結果表明,以phytagel為固化劑,0.1mg/L6-BA+0.

4、1mg/LIAA最適于莖尖不定芽的誘導,1/2MSB+O.1mg/LIAA+0.1mg/LNAA誘導生根效果最佳。在75mg/LKan篩選下,以OD600為0.9的農桿菌菌液侵染25min,22℃共培養(yǎng)48h,卡那篩選陽性率最高。采用該轉化體系將GhGST轉化邯208,經PCR檢測獲得了3株轉基因陽性植株。
　　 4.通過研究無菌苗培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時間、下胚軸處理方式和農桿菌種類對出愈率的影響,結果表明,無菌苗暗培養(yǎng)3d,切下下胚