利用模式植物擬南芥鑒定和分離大麗輪枝菌外泌毒素中的致萎活性因子.pdf

1、黃萎病是一種世界性病害，其寄主范圍廣，作用機理復雜，致病途徑多樣，難于防治，己成為嚴重影響以棉花為主的多種重要經濟作物的產量與品質的重要真菌性病害。由于棉花等作物遺傳背景復雜，很難在分子水平進行更深入的研究，另外黃萎病菌(大麗輪枝菌)小種分化變異性強等原因也為抗病遺傳育種帶來重重困難。建立擬南芥與大麗輪枝菌互作的模型，可以充分利用擬南芥這一模式植物的各種優(yōu)勢，促進病原菌與寄主植物互作的信號轉導分子機制研究。已有的研究表明，黃萎病菌分泌的

2、致萎毒素是導致寄主植物萎蔫的主要原因，而且毒素成分極為復雜。研究黃萎病菌分泌的致萎毒素的有效成分，獲得擬南芥與病原微生物互作信號轉導的詳細信息，對全面了解抗病和感病反應機理、從而控制黃萎病的發(fā)生具有重要意義。 本論文研究工作的主要目的是利用擬南芥和大麗輪枝菌互作研究系統(tǒng)鑒定和分離病原菌分泌毒素中的活性致萎因子，以期為進一步鑒定克隆與活性致萎因子互作的寄主基因。論文實驗工作主要是利用液相色譜和質譜等技術對黃萎病菌培養(yǎng)物外泌毒素進行

3、分步深度純化，通過接種擬南芥進行性狀觀察而檢測各分離組分致萎活性。黃萎病菌液體培養(yǎng)的粗毒素經凝膠柱層析，得到2個有紫外吸收(OD280)的組分(P1和P2)。對這2個組分以及峰間無紫外吸收部分的致萎活性分析表明，其中P2組分具有明顯的致萎活性。利用P2組分針刺成苗葉片或加入培養(yǎng)基對幼苗處理，結果均誘發(fā)與粗毒素處理一致的癥狀，使成苗葉片產生過敏性壞死斑點或抑制幼苗生長、使幼苗白化。針刺葉片實驗還表明，P2組分處理誘導擬南芥病程相關蛋白PR

4、1基因的表達，作為水楊酸信號途徑的標記基因，PR1表達量在處理48小時達到最大。這說明P2具有外源激發(fā)子的作用，誘導擬南芥產生抗性。根據(jù)層析保留時間初步判定P2組分是小分子物質的混合物。利用離子交換色譜(IEX)對P2組分進一步分離純化得到5個組分(D1～D5)，其中D1組分的致萎活性明顯強于其它組分。利用高效液相色譜(HPLC)對D1分析，得到一個有致萎活性的組分H112，對H112組分的質譜分析結果表明其小分子物質，化學分析表明可能