南極假絲酵母脂肪酶B高效表達及在選擇性?；矫娴膽醚芯?pdf

1、南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctic lipase B， CALB）來源于南極假絲酵母，是一種優(yōu)良的脂肪酶，它對水溶性、非水溶性物質都有很強的催化活性，在有機合成、手性化合物拆分、醫(yī)藥中間體等領域得到廣泛應用。然而南極假絲酵母產酶量低，發(fā)酵周期長，遠不能滿足目前的需求。而通過基因改良的米曲霉發(fā)酵獲得的CALB，其售價約為16000元/千克，不適合工業(yè)化應用。
　　 本課題主要目的是以畢赤酵母（Pichia p

2、astoris）作為表達系統(tǒng)，通過基因工程手段提高CALB的表達量，從而降低其工業(yè)應用的成本。主要研究內容及其結果如下：
　　 首先，探索野生型CALB基因在畢赤酵母表達的可行性。以南極假絲酵母基因組為模板擴增CALB基因的前導肽（pro-peptide）和編碼成熟肽(mat-peptide)部分，將PCR擴增產物插入pPIC9K的多克隆位點，得到重組質粒pPIC9K-CALB，將其線性化后轉化畢赤酵母GS115，最終獲得8拷貝

3、數的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-CALB。對GS115-pPIC9K-CALB進行甲醇誘導，收集不同誘導時間的上清液進行酶活測定和SDS-PAGE分析，結果表明畢赤酵母無法表達野生型CALB。
　　 其次，鑒于野生型CALB基因無法在畢赤酵母系統(tǒng)實現表達，根據CALB的氨基酸序列（GenBank accession No. Z30645.1），采用巴斯德畢赤酵母偏好密碼子重新設計CALB基因序列，序列保留pro-pep

4、tide和mat-peptide部分，并在序列的下游添加His-Tag標簽序列，合成優(yōu)化序列。將序列插入pPIC9K的多克隆位點得到重組質粒pPIC9K-syCALB，轉化畢赤酵母GS115后得到重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB。經過1％甲醇誘導120h，酶活力達到最大值46U mL-1，蛋白表達量為242.2mg L-1。SDS-PAGE分析表明重組CALB分子量為35kd和38kd，比野生型CALB略大。通過金屬螯

5、合層析對發(fā)酵上清液純化，將目的蛋白純化了5.23倍，比活達到856.7U mg-1，酶活的回收率達到81.2%。對重組CALB進行酶學性質研究發(fā)現，其最適反應溫度和pH分別為30℃和6.5，CALB在pH為5.0-8.0之間、40℃以下有較好穩(wěn)定性，Ca2+，2n2+，Mn2+有助于酶活的提高，而Cu2+，Ag+，Fe3+強烈抑制酶催化反應。搖瓶優(yōu)化階段，確定最優(yōu)誘導培養(yǎng)基為BMMY，培養(yǎng)基最適pH為6.0，最佳誘導溫度為20℃，甲醇最

6、適添加量為2%。使用3.6L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB，采用變溫發(fā)酵策略，以BSM作為培養(yǎng)基。前期流加甘油充當碳源，30℃培養(yǎng)；當細胞干重為25.7g L-1時進行甲醇誘導，誘導溫度為20℃，甲醇起始流加速率為1.8mLh-1 L-1，根據溶氧變化手動控制甲醇流加速率，維持溶氧值為25%。誘導112h后酶活為163.7U mL-1，蛋白濃度在誘導124h達到最大值，為824.7mg L-1。

7、>　　 最后，在畢赤酵母高效表達CALB的基礎上，嘗試以聚丙烯樹脂(PP)固定化CALB，并以PP-CALB催化維生素A前體的單?；磻?。以商品化CALB，即Novozyme435優(yōu)化得到最佳反應條件：溶劑為正己烷（分子篩干燥除水），?；w為乙酸乙烯酯，其與維生素A前體的摩爾比控制在3∶1，酶添加量為5mg mL-1，反應溫度50℃，反應時間90min。Novozyme435和PP-CALB對氫化物轉化率分別為88.7%和39%，產