膽鹽水解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、膽鹽水解酶降低人體血清膽固醇的功能可應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生領(lǐng)域。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌具有降低膽固醇的能力，這與其所產(chǎn)膽鹽水解酶有關(guān)，因此本實驗選用植物乳桿菌為出發(fā)菌株，發(fā)酵產(chǎn)膽鹽水解酶，對其培養(yǎng)基成分及產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化、并對膽鹽水解酶進行分離純化，研究了該酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。
　　 為了提高菌株的產(chǎn)酶能力，本研究對植物乳桿菌產(chǎn)膽鹽水解酶的培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。利用單因素實驗研究不同碳源、氮源

2、、無機鹽對酶產(chǎn)量的影響，并確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的主要組成。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖19.40、蛋白胨17.05、大豆蛋白胨14.00、乙酸鈉1.82、K2HPO42.00、酵母浸粉6.00、檸檬酸氫二銨1.00、MgSO40.87、MnSO40.45、L-半胱氨酸0.5、吐溫-802.2mL/L。利用該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶，使膽鹽水解酶的產(chǎn)量由原來的1.09U/mL提高到7.02±0.28U/mL，提高了

3、6.44倍。用正交試驗優(yōu)化獲得了最佳產(chǎn)酶條件為:初始pH值6.2;培養(yǎng)溫度39℃;接種量7％;裝液量50％。根據(jù)植物乳桿菌的生長曲線和產(chǎn)酶曲線確定最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)時間為20h。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，膽鹽水解酶活可以達8.41±0.13U/mL，比原始提高了7.72倍。
　　 對所產(chǎn)的膽鹽水解酶進行分離純化。將粗酶液進行硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-SepharoseFastFlow、SephadexG-100凝膠過濾層析，

4、將所得到的膽鹽水解酶進行SDS-PAGE檢測，得到膽鹽水解酶的分子量約為40kDa。經(jīng)過純化后的蛋白酶比活力由6.62AU提高到168.02AU，純化倍數(shù)為24.78倍，回收率達到13.28％。
　　 將純化得到的膽鹽水解酶進行酶學(xué)性質(zhì)的研究。該酶的最適溫度為37℃，在20-35℃范圍內(nèi)放置80min，該酶仍能保持80％以上活性;最適pH值為6.0，在pH4-10的范圍內(nèi)該酶活性比較穩(wěn)定，37℃處理1h后，殘留酶活力在80％以上

5、;金屬離子對酶活性有一定影響，當添加的金屬離子濃度為1mmol/L時，Pb2+、Hg2+、Fe3+、Al3+對膽鹽水解酶活力有一定抑制作用，Cu2+、Ca2+對膽鹽水解酶活力有微弱促進作用;當有機溶劑濃度為1％時，正丙醇對該酶有微弱激活作用;當有機溶劑的濃度由1％升到10％時，甲醇、乙醇對該酶有抑制作用，其酶活力分別為對照組的34.84％、49.27％;膽鹽水解酶的最適底物為5mmol/L的?；悄懰徕c溶液;SDS、H2O2、Pepsta

6、inA、Leupeptin在一定程度上對膽鹽水解酶有較強抑制作用。當SDS濃度分別為1mmol/L和5mmol/L時，殘余酶活力分別為69.90％和68.80％;當H2O2濃度為1％和10％時殘余酶活力分別為40.67％和23.98％;當PepstainA濃度分別為0.1μmol/L和1μmol/L時，殘余酶活力分別為47.69％和40.08％;當Leupeptin濃度分別為10μmol/L和100μmol/L時，殘余酶活力為53.76