LuxS-AI-2密度感應信號影響草綠色鏈球菌生物膜致病力的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第1章 VS多藥耐藥野生株的分離與鑒定
　　目的：獲得研究所需目標菌株——草綠色鏈球菌多藥耐藥臨床分離野生株。
　　方法：臨床標本通過血平板培養(yǎng)、革蘭染色、藥敏試驗篩選出疑似目標菌株;純培養(yǎng)后行生理、生化試驗，提取細菌基因DNA，多聚酶鏈式反應(PCR)擴增16SrDNA，測序后上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫與已知序列比較，行16S rDNA序列同源性分析。
　　結果：臨床分離多藥耐藥

2、野生株(327045號)，革蘭染色陽性鏈球菌;α溶血;生化實驗提示D群鏈球菌，緩癥鏈球菌可能性大;16S rDNA序列同源性分析顯示與緩癥鏈球菌(S.mitis)同源性最高，99.58％。
　　結論:臨床分離野生株(327045號)屬于草綠色鏈球菌多藥耐藥野生株。成功獲得本研究所需目標菌株。
　　第2章 VS多藥耐藥野生株的致病力檢測
　　目的:了解目標菌株——草綠色鏈球菌多藥耐藥臨床分離野生株的致病力，為下一步比較實

3、驗獲取基線數(shù)據(jù)。
　　方法:通過野生株上清液誘導V.harveyiBB170報告菌株生物發(fā)光實驗檢測VS多藥耐藥野生株AI-2信號分子的存在與活性;酶標儀測量VS多藥耐藥野生株形成生物膜的吸光光度值，了解其生物膜形成能力;定量分析不同時間、不同類型、不同濃度抗生素對VS野生株生物膜形成量的影響，了解其耐藥性，數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，進行析因資料方差分析和單因素方差分析;Fluorecein Stain、18909 Ca

4、lcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡掃描觀測VS多藥耐藥野生株生物膜結構、胞外多糖分布、死活菌分布，全面了解VS多藥耐藥野生株的致病力表型。
　　結果:析因資料方差分析顯示抗生素種類與濃度(P=0.034)、抗生素種類與干預時間(P＜0.001)、抗生素濃度與干預時間(P=0.010)皆存在交互作用;主效應分析

5、顯示抗生素類型(P＜0.001)、抗生素濃度(P＜0.001)、干預時間(P＜0.001)均可影響VS多藥耐藥野生株的BF形成。經(jīng)單因素方差分析Dunnett t-tests多重比較顯示初始期，環(huán)丙沙星耐藥濃度(P=0.001)、中敏濃度(P＜0.001)、敏感濃度(P＜0.001)，四環(huán)素耐藥濃度(P=0.012)、中敏濃度(P=0.009)、敏感濃度(P=0.001)實驗組中抗生素均有效減少了VS多藥耐藥野生株BF的形成;中間指數(shù)期

6、，實驗組BF形成量與菌液對照組均不存在顯著性差異(P＞0.05)。生物膜結構復雜，且不均一;胞外多糖、死活菌分布特點多樣，可受抗生素干預因素影響。
　　結論:VS多藥耐藥野生株具有極強的生物膜形成能力和多重耐藥性，致病力高，值得臨床關注;抗生素治療應遵循實驗室檢查結果。
　　第3章 VS LuxS基因突變株的構建
　　目的:通過同源重組法敲除VS多藥耐藥野生株的LuxS基因，構建VS LuxS基因突變株，為進一步研究L

7、uxS基因在VS生物膜形成與耐藥性變化中的作用做準備。
　　方法:運用同源重組法設計合成引物，分別以質粒PMG36E、VS多藥耐藥野生株(327045)DNA為模板，應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到紅霉素抗性(Erm.)基因DNA片斷和LuxS基因上下游序列，經(jīng)雙酶切反應插入pUC19質粒的多克隆酶切位點中，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，氨芐青霉和紅霉素培養(yǎng)基篩選，將載體質粒轉化到含完整LuxS基因的VS多藥耐藥野生株(327045)

8、中，利用紅霉素抗性培養(yǎng)基篩選出LuxS基因缺陷突變株，并利用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測。
　　結果:PCR凝膠電泳結果顯示:紅霉素抗性基因和LuxS基因兩側同源序列成功連入到Puc19質粒相應酶切位點，VS LuxS基因突變株LuxS基因完全被紅霉素抗性(Erm.)基因所取代。
　　結論:成功構建VS LuxS突變株。
　　第4章 LuxS基因缺失對VS野生株致病力的影響
　　目的:了解LuxS/AI-2密度感

9、應信號缺失對VS多藥耐藥野生株生物膜致病力的影響，嘗試探討可能存在的機制。
　　方法:V.harveyi BB170報告菌株生物發(fā)光實驗檢測AI-2信號分子的存在與活性;吸光光度值定量分析VS多藥耐藥野生株與LuxS基因突變株生物膜形成量與耐藥性差異;Fluorecein Stain、18909 CalcofluorWhite Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain熒光

10、染色后，激光共聚焦顯微鏡掃描VS多藥耐藥野生株與LuxS基因突變株BF，比較二者在生物膜結構、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差異;通過野生株上清液、DPD補償生長實驗確認VS突變株表型發(fā)生的原因。數(shù)據(jù)輸入SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，進行Kolmogorov-Smirno test非參數(shù)檢驗。
　　結果:Kolmogorov-Smirno test顯示:VS LuxS基因突變株與野生株菌液BF形成量存在顯著性差異(P＜0.001);

11、同樣條件下，氨芐西林(P＜0.001)、環(huán)丙沙星（P＜0.05）、四環(huán)素(P＜0.001)干預VS LuxS基因突變株與野生株BF形成量均存在顯著性差異。突變株菌液BF形成量與VS野生株上清液、DPD補償實驗組BF形成量，均存在顯著性差異（P＜0.001）;野生株菌液BF形成量與VS野生株上清液(P=0.320)、DPD(P=0.683)補償生長實驗組BF形成量均不存在統(tǒng)計學差異。VS LuxS基因突變株生物膜形成量減少，結構疏松改變，