鉤端螺旋體對血管內皮細胞單層侵襲性研究及rel基因功能分析.pdf

1、鉤端螺旋體?。ㄒ韵潞喎Q鉤體病）是由致病性鉤端螺旋體(以下簡稱鉤體)感染引起的人獸共患病，鼠類和豬是主要的傳染源，在全世界范圍內廣泛流行。
　　 鉤體的致病機制目前并不明確。黏附和侵襲是鉤體致病的第一步。鉤體可以通過破損的皮膚和黏膜進入人體，并迅速進入到血管，隨血流到達靶器官后定植。這一過程在鉤體致病中發(fā)揮著十分重要的作用。因此，本研究的第一部分首先利用Transwell小室和EAhy926細胞建立內皮細胞單層模型，在體外模擬血管

2、壁結構，分別加入鉤體有毒株56606v株，減毒株56606a株、腐生型PatocⅠ株、傷寒沙門菌14028菌株（陽性對照）和大腸埃希菌DH5α菌株（陰性對照），暗視野顯微鏡下計數到達Transwell下室細菌的數量，吸取下室液體檢測熒光強度以評估內皮細胞單層通透性改變，流式細胞術檢測鉤體是否引起內皮細胞凋亡，透射電鏡下觀察鉤體穿透內皮細胞單層的形態(tài)特征。
　　 結果發(fā)現，56606v株對內皮細胞單層的穿透速度和穿透能力明顯優(yōu)于5

3、6606a株和PatocⅠ株；不同毒力的鉤體感染內皮細胞單層，單層通透性均無明顯改變；56606v株和56606a株均未引起內皮細胞發(fā)生明顯凋亡；鉤體穿透內皮細胞單層主要是通過內皮細胞胞體而非細胞間緊密連接。本部分研究說明有毒株鉤體對內皮細胞單層的穿透能力明顯強于減毒株和腐生型鉤體，其穿透能力可能與致病有關。不同毒力的鉤體均不引起內皮細胞單層通透性的增加，也不引起內皮細胞凋亡。
　　 細菌嚴謹反應是指細菌在氨基酸饑餓，或碳源、溫

4、度、pH和鐵含量等變化時，細菌做出的應急反應，產生鳥苷四磷酸（ppGpp）或鳥苷五磷酸(pppGpp)，統(tǒng)稱為(p)ppGpp，關閉大部分代謝活性，提高菌株抗逆能力。嚴謹反應不僅是細菌適應不良環(huán)境的一種應激反應，也與致病菌的黏附性、毒素表達、運動性及其他毒力因子的調控有著密切聯(lián)系。我們推測鉤體與嚴謹反應相關的rel基因也與鉤體毒力因子的表達和調控密切相關。
　　 本研究的第二部分主要致力于對鉤端螺旋體Lai株rel基因的功能分析

5、。首先構建了鉤體Lai株rel基因的重組互補質粒，異源回補至relA和spoT基因缺陷的大腸埃希菌（CF1678）體內，根據回補后的CF1678菌株能否在MOPS固體培養(yǎng)基上生長，可以判斷Lai株rel基因是否能回補大腸埃希菌relA和spoT基因的功能。將Lai株Rel蛋白的不同結構域的編碼基因，分段回補至CF1678菌株中，分析各個結構域在Lai株的Rel蛋白中的作用。
　　 結果發(fā)現，Lai株rel基因回補到CF1678菌

6、株體內，可以回復CF1678菌株在MOPS培養(yǎng)基上的生長。Rel蛋白的不同結構域編碼基因分段回補，發(fā)現缺失了HD結構域編碼基因的片段回補CF1678菌株，該菌株不能在MOPS固體培養(yǎng)基上生長。而缺失TGS或ACT結構域編碼基因的片段回補，該菌株仍能在MOPS固體培養(yǎng)基上生長。本部分研究通過異源互補實驗，發(fā)現鉤體Lai株rel基因具有和大腸埃希菌relA和spoT基因相似的功能。HD結構域可能在Rel蛋白中發(fā)揮磷酸水解酶功能，而TGS和A