基于內(nèi)部核糖體進入位點提高重組NDV表達vvIBDV VP2基因的研究.pdf

1、隨著反向遺傳操作技術(shù)的成熟，利用新城疫病毒(NDV)作為病毒活載體研制多價疫苗已進入成熟階段。目前已有將IBDV免疫保護性抗原VP2蛋白的基因、IBV免疫保護性抗原S蛋白的基因及H5亞型禽流感病毒的HA基因分別插入到新城疫病毒，進行重組新城疫病毒活載體二聯(lián)苗的研究。以病毒為表達載體研制的大多數(shù)基因工程疫苗存在外源病原的免疫保護性基因的表達量低這一問題，因而達不到預(yù)期的免疫效果。以NDV為活載體的基因工程疫苗也不例外，外源免疫保護性基因插

2、入NDV適宜位點后表達量較低，限制了重組NDV疫苗的效果和使用，因此如何提高外源基因表達量成為該類疫苗研發(fā)的瓶頸問題。
　　 VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)性蛋白，具有良好的抗原性，在宿主體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，因此VP2基因是研究IBDV疫苗的重要目的基因。為了提高重組NDV外源基因表達量，本研究采用內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)構(gòu)建表達雞傳染性法氏囊病病毒超強毒(vvIBDV) HLJ07株VP2雙拷貝基因的重組NDV(

3、rClone30-VP2-IRES-VP2)，同時構(gòu)建表達單拷貝VP2基因的重組NDV(rClone30-VP2)作為對照。利用PCR方法分別將HpaⅠ、BamHⅠ和SacⅡ引入VP2基因的5'端和3'端;將BamHⅠ、EcoRⅠ、MluⅠ和SacⅡ引入IRES基因的5'端和3'端;EcoRⅠ、BamHⅠ和MluⅠ引入第二個VP2基因的5'端和3'端。將其分別克隆至pMD18-T。依次通過BamHⅠ和SacⅡ?qū)RES基因克隆至VP2基

4、因的3'端，通過EcoRⅠ和MluⅠ將第二個VP2基因克隆至IRES基因的3'端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-VP2-IRES-VP2。將VP2-IRES-VP2片段插入pClone30的MCS位點中，構(gòu)建帶有VP2-IRES-VP2基因片段的NDV全長cDNA，并將攜帶全長cDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pClone30-VP2-IRES-VP2。構(gòu)建的pClone30-VP2-IRES-VP2質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切除去IRES-VP2，將酶切后的片段

5、自連得到pClone30-VP2。將兩種轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒分別與表達核衣殼蛋白、磷酸化蛋白和大聚合酶蛋白的輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶的BHK-21細胞，拯救獲得的重組病毒通過雞胚進行增殖并收集尿囊液，重組病毒分別命名為新城疫rClone30-VP2-IRES-VP2株和rClone30-VP2株。
　　 在雞胚成纖維細胞中進行的重組病毒增殖實驗表明，VP2基因和VP2-IRES-VP2基因片段的插入并未對病毒在細胞內(nèi)的增

6、殖能力造成影響。間接免疫熒光試驗(IFA)表明VP2蛋白在感染兩種重組病毒的雞胚成纖維細胞(DF-1)中均有表達。Real-time PCR檢測結(jié)果表明rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于rClone30-VP2對照組。重組NDV以0.00001MOI感染HepG2細胞時，rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA的相對表達量是rClone30-VP2的1.6倍。