5-脂氧合酶在神經細胞損傷中作用的研究.pdf

1、該研究中,我們采用轉染5LO的策略,研究神經細胞5LO功能,觀察內源性表達5LO是否影響PC12細胞增殖、分化,是否影響細胞對一些致AD損傷因素如淀粉樣蛋白、無營養(yǎng)因子等的反應性:1.將HindⅢ限制性酶切位點插入質粒pBI-G的多克隆位點中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克隆入該載體的HindⅢ限制性酶切位點插入質粒pBI-G的多克隆位點中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克HindⅢ限制性酶切位點插入質粒pBI-G的多

2、克隆位點中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克隆入載體的HindⅢ和Sa/I位點獲得誘導表達載體pBI-5LO.采用酶切分析及測序驗證,對獲得的載體進行確證.2.采用報告基因β-半乳糖苷酶組化染色的方法,在PC12細胞模型上對5LO Tet-On誘導表達系統(tǒng)進行工作測試,加入誘導劑多西環(huán)素1μg/ml孵育48h后,對細胞進行染色,陽性細胞被染為亮蘭色,表明該誘導表達系統(tǒng)在PC12細胞上能夠工作.3.誘導表達載體pBI-5LO采用F

3、uGENE 6試劑轉染PC12細胞,潮霉素50μg/ml加壓篩選分離克隆,以測定報告基因β-半乳糖苷酶活生的方法進行初篩,然后用RT-PCR測定5LO mRNA Western blot測定5LO蛋白、反相HPLC測定5LO活性的方法進行確證,獲得5LO誘導表達PC12細胞.4.采用綠熒光蛋白和5LO的融合研究5LO在PC12細胞的亞細胞定位,融合蛋白與核染料Hoechst33258共定位,表明5LO在PC12細胞可分布于細胞核內.5.

4、采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法測定細胞增殖、NGF(200U/ml)誘導細胞分化等方法,發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下5LO誘導表達對PC12細胞的形態(tài)、增殖和分化沒有明顯影響.6.采用臺盤蘭染色、MTT法、流式細胞儀等測定細胞死亡.淀粉樣蛋白肽Aβ25-35(5μM)孵育48h,與對照相比,5LO誘導表達細胞死亡率顯著增加;無血清培養(yǎng)48h,5LO表達細胞死亡率顯著高于對照組;NGF誘導PC12細胞分化7d后,撤除NGF后48h,5L

5、O表達也顯著增加細胞的死亡率.7.采用測定細胞上清LDH活性的方法測定細胞損傷.5LO抑制劑AA861(5μM)、MK886(5μM)均能顯著抑制Aβ25-35(5μM)誘導的細胞損傷.8.采用生化法測定超氧化物酶(SOD)、過氧化氫酶(Cat)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),MDA法測定脂質過氧化,DCF熒光法測定過氧化物水平,Ac-DEVD-AMC底物熒光法測定Caspase-3活性,RT-PCR方法測定凋亡相關基因的表達.5