活性多肽類似物的設計、制備和功能研究.pdf

1、多肽及較小的寡肽，在激素調控、細胞免疫、信息傳遞等，生命活動中日益顯示重要的生物功能。為研究它們的作用機理，多肽合成是提供這些多肽的有效途徑，至于N端、C端及側鏈經過加工的天然多肽或含有非編碼氨基酸多肽的制備，目前仍必須依靠多肽的化學合成或體外的酶促合成。 本論文研究活性多肽類似物的設計、制備和功能，分為四個部分，采用多肽固相和液相合成的方法，分別合成了活性多肽綠豆胰蛋白酶抑制劑Lvs片段長鏈16肽、天花粉胰蛋白酶抑制劑、癌胚

2、抗原肽、甜味肽等一系列類似物，并測定了這些類似物的生物活性，有以下新的研究結果：1、furin酶抑制劑的設計、制備和功能；2、芳香氨基酸芳環(huán)之間的π-π共軛能部分補償二硫鍵的作用；3、癌胚抗原肽Glv4被L-Pro替代可增加與HLA-A2分子的結合；4、肽鍵對甜味肽保持甜味是必須的。 第一章是將綠豆胰蛋白酶抑制劑Lvs片段改造為furin和kexin抑制劑。高活性、低分子量的furin酶抑制劑有可能發(fā)展成為新型的抗細菌內毒素和

3、抗病毒感染的藥物，我們以綠豆胰蛋白酶抑制劑Lys片段長鏈22肽為模板，設計了一系列能抑制furin和kexin活性的突變體，采用如下三種方法逐步優(yōu)化：一、去除Lys片段長鏈三對二硫鍵中的一對，用Ser替換Cys，減少可能存在的二硫鍵錯誤配對；二、抑制劑的活性中心根據furin底物的專一性逐步改變，即P1、P2、P4和P6位分別變?yōu)锳rg、Lys、Arg和Arg，同時為了避免P<,7>Asp和P<,6>Arg之間可能存在的相互作用，將P<

4、,7>位Asp替換為Ala；三、將兩對二硫鍵形成的雙環(huán)的外面5個氨基酸殘基去除。最后所得的16肽對fufin和kexin的抑制常數(shù)分別為：2.45×10<'-9>M和5.60x1O<'-7>M。上述得到的突變體抑制劑為‘自殺性’抑制劑，若與酶長時期保溫，P<,1>與P’<,1>間的肽鍵將被裂解，抑制活性也就喪失。進一步將P’<,1>位Ser變?yōu)镈-Ser或N-methyl Set，P’<,1>位為N-methyl Ser的突變體對fur

5、in的抑制活力為4.70x10<'-8>M，與酶保溫3小時后仍保留80％以上的抑制活性，P’<,1>位為D-Ser的突變體與酶保溫3小時后抑制活性幾乎不變，但它的抑制常數(shù)(Ki)大大增加。因此N-methvl Ser的突變體對furin有較強的抑制活性，也不易被降解，是一種較理想的furin抑制劑，為進一步研究發(fā)展為抗病毒和細菌外毒素的藥物提供了實驗依據。 第二章是對天花粉胰蛋白酶抑制劑的兩對二硫鍵的作用進行了研究，二硫鍵在蛋

6、白質的折疊和功能中有重要的作用，芳香族氨基酸的芳環(huán)之間形成π-π共軛能否部分補償二硫鍵的作用?我們將天花粉胰蛋白酶抑制劑(Trichosanthes trypsininhibitor I，TTI)的Cys14-Cys26或Cys8-Cys20的二硫鍵分別替換為Tyr和Phe，C14F-C26Y的突變體抑制活性為M6A-TTI-I的1／140。作為陰性對照的C14S-C26S突變體沒有活性(Ki>0.4 mM)，Tyr和Phe間的π-π共

7、軛可部分地補償了CyS14-Cys26二硫鍵的作用。C8Y-C20F和C8S-C20S突變體都沒有胰蛋白酶抑制活性(Ki>0.4 mM)，Cys8-Cys20二硫鍵的作用不能被Tyr和Phe聞的相互作用替代。說明蛋白質的某些二硫鍵作用可以被芳香族氨基酸的芳環(huán)之間形成的π-π共軛部分補償，但是這種補償作用在一定條件下才能發(fā)生。 第三章是研究癌胚抗原肽CAP-1(YLSGANLNL)的1-5位氨基酸殘基對其活性的影響。癌胚抗原肽是

8、一種HLA-A2限制的抗原表位，由于中國人群中HLA-A2陽性率大于40％，而且90％的胃癌、結腸癌和直腸癌患者癌胚抗原的表達呈陽性，因此這個抗原表位有極高的應用價值，臨床已使用自體樹突狀細胞遞呈癌胚抗原肽CAP-1治療癌胚抗原陽性的腫瘤患者。為了進一步研究CAP-1的各個位點的氨基酸殘基與其活性的關系，我們合成了一些CAP-1的第1，2，3，4，5位氨基酸分別替換為其他的氨基酸的類似物，并測定這些類似物與HLA-A2分子的結合能力和產

9、生殺傷性T細胞的能力。其中Gly4變?yōu)長-Pro的肽(YLSPANLNL)HLA-A2分子的結合能力比CAP-1高，但是產生殺傷性T細胞的能力比CAP-1略低，提示Gly4對CAP-1與HLA-A2分子的結合以及與T細胞受體結合都有影響，為進一步研究提供了方向。 第四章是研究甜味肽的結構和功能，甜味肽(L-天冬氨酸-L-苯丙氨酸甲酯)的肽鍵替換為酯鍵，甜味消失。甜味肽X射線晶體結構研究表明肽鍵的“-NH”可與L-天冬氨酸側鏈羧