補腎、調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復機制影響的比較研究.pdf

1、腎藏精，主生殖；肝藏血，主疏泄?；谝韵氯矫妫阂皇恰案文I同源理論”：腎藏精，肝藏血，血的化生有賴于腎中精氣的氣化；腎中精氣的充盛，亦有賴于血的滋養(yǎng)。二是腎肝為母子之臟，母病可累及子病，子病可累及母病，臨床對于婦科疾病的治療，每每以腎為先，肝腎并治。三是中醫(yī)腎、肝與月經(jīng)周期的關系：腎氣的開闔藏瀉決定著沖任血海的充盈溢泄，從而形成月經(jīng)周期。肝主疏泄，與腎主封藏之間，存在著相互制約、相反相成的關系。肝疏泄功能正常，女子定期才有月經(jīng)的排泄。因

2、此，腎肝與月經(jīng)不調(diào)關系密切。月經(jīng)先后不定期、經(jīng)量過多、經(jīng)期延長、崩漏等月經(jīng)不調(diào)以及由此導致的不孕癥皆與子宮內(nèi)膜修復異常有關系。臨床從腎肝辨治月經(jīng)失調(diào)取得了明顯的療效。
　　1984年FinnCA等用人工刺激子宮蛻膜化后撤退孕酮，使得小鼠子宮發(fā)生月經(jīng)樣改變，建立了第一個小鼠月經(jīng)模型，對研究子宮內(nèi)膜的變化建立了平臺。我們前期預試驗利用激素序貫法復制小鼠月經(jīng)模型，并觀察了激素撤退后0h、8h、12h、16h、24h、32h、40h、48

3、h、72h的小鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學周期變化，結果顯示小鼠子宮內(nèi)膜變化均有人類增殖期、分泌期、崩解及修復的特征。12-16小時子宮內(nèi)膜開始崩解，24h出血強度最大且伴隨著子宮內(nèi)膜的初始修復，72h子宮內(nèi)膜完全修復。為進一步探究腎肝對子宮內(nèi)膜修復的影響機制，我們選取24h、32h、40h、48h、72h為觀察點，比較了補腎方、調(diào)肝方、補腎調(diào)肝方（補腎方+調(diào)肝方）三方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復的影響。
　　第一部分補腎、調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)

4、模型子宮內(nèi)膜修復形態(tài)學的影響
　　目的：觀察比較補腎、調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復形態(tài)學的影響。
　　方法：C57BL/6J雌性小鼠7-8周齡200只，采用隨機數(shù)字表法分為4組：對照組，補腎組，調(diào)肝組、補腎調(diào)肝組（補腎方+調(diào)肝方組），每組50只。復制小鼠月經(jīng)模型：行雙側卵巢切除術后恢復1周，在第1-3d皮下注射100ng雌二醇（E2）；第7d將孕酮（P）皮埋管埋植于小鼠背部皮下，同時皮下注射50ngP和5ng E2；第8

5、-9d，繼續(xù)皮下注射5ng E2；在第9d的11：30，將15μl過濾除菌的花生油注射到小鼠右側子宮角以誘導蛻膜化，未注射花生油的一側子宮角作為對照，同時記錄每只小鼠花生油注射的時間。
　　蛻膜化誘導49h后，取出孕酮皮埋管（將此時間點作為孕酮撤退的0h）。各實驗組在第10d分別給予補腎方、調(diào)肝方、補腎調(diào)肝方0.4ml灌胃，對照組用等容積蒸餾水，至第14d結束。在24h、32h、40h、48h、72h處死小鼠，取血，檢測各組血清E

6、2水平，取下子宮角，拍照，組織切片進行觀察并評分。
　　結果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h血清E2水平的比較
　　1.1同一組不同時間點血清E2水平
　　對照組血清E2水平，24h、32h均高于48h（P＜0.05），而48h高于72h（P＜0.05）。補腎組呈逐漸升高趨勢，48h、72h均高于24h（P＜0.05）。調(diào)肝組24h分別高于32h、40h（P＜0.05）。補腎調(diào)

7、肝組32h達高峰（P＜0.05）。
　　1.2同一時間點不同組間血清E2水平比較
　　與對照組比較，24h、40h，補腎組、調(diào)肝組、補腎調(diào)肝組血清 E2水平均顯著降低（P＜0.05）。32h，補腎組、調(diào)肝組顯著降低（P＜0.05），而補腎調(diào)肝組顯著升高（P＜0.05）；各實驗組比較，24h，補腎組最低（P＜0.05）；在32h，補腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、

8、72h子宮內(nèi)膜修復形態(tài)學評分比較
　　2.1同一組不同時間點子宮內(nèi)膜修復形態(tài)學評分
　　各組子宮內(nèi)膜形態(tài)學評分均于48h、72h達到最高（P＜0.05）。
　　2.2同一時間點不同組間子宮內(nèi)膜修復形態(tài)學評分比較
　　隨時間的延長，補腎組子宮內(nèi)膜形態(tài)學評分高于補腎調(diào)肝組，后者高于調(diào)肝組，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而調(diào)肝組與對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　結論：實驗結果表明，E2水平高低對子宮內(nèi)

9、膜修復無明顯影響。補腎方、補腎調(diào)肝方均能促進子宮內(nèi)膜修復，補腎方優(yōu)于補腎調(diào)肝方。調(diào)肝方對子宮內(nèi)膜修復無明顯影響。
　　第二部分補腎、調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜CXCL2、Bcl-2影響的比較
　　目的：探討補腎方、調(diào)肝方、補腎調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜CXCL2、Bcl-2蛋白表達的影響，以比較三方影響子宮內(nèi)膜修復的機制。
　　方法：動物分組及取材同第一部分。子宮角一部分取出浸入4％多聚甲醛固定，剩余部分凍存液氮，

10、然后-80℃放置備測。分別采用免疫組化SP法和Western blot檢測CXCL2、Bcl-2蛋白的表達。
　　結果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白的表達
　　1.1同一組不同時間點子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白的表達
　　在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h，各組子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白表達均于32h、48h達高峰（P＜0.05）。
　　1.

11、2同一時間點不同組間CXCL2蛋白表達的比較
　　與對照組比較，各個時間點，補腎組、調(diào)肝組和補腎調(diào)肝組子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；各實驗組比較，24h、48h、72h，補腎組、調(diào)肝組、補腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05），補腎調(diào)肝組32h最低，40h最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白的表達
　　2.1同一組不同時間點

12、子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白的表達
　　各組Bcl-2蛋白表達呈先升高后降低的趨勢，48h達高峰（P＜0.05）。
　　2.2同一時間點不同組間Bcl-2蛋白表達的比較
　　與對照組比較，各個時間點，補腎組、調(diào)肝組和補腎調(diào)肝組子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白表達均升高；各實驗組比較，24h，補腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。32h，調(diào)肝組、補腎組、補腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。40h，補腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。48h，補

13、腎組、調(diào)肝組、補腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。72h，補腎組最高（P＜0.05）。
　　結論：補腎方、補腎調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜內(nèi)膜修復影響的作用機制相似，二者均能通過上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜CXCL2和Bcl-2的蛋白表達，在調(diào)節(jié)炎性反應因子方面影響子宮內(nèi)膜修復，尤以補腎方更為明顯?？赡芘c其不僅能增加CXCL2、Bcl-2蛋白的表達，且能維持較長時間有關。調(diào)肝方雖能上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜CXCL2和Bcl-2蛋白表達，但未能加快

14、子宮內(nèi)膜修復。
　　第三部分補腎、調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜 VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達影響的比較
　　目的：探討補腎方、調(diào)肝方、補腎調(diào)肝方對小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達的影響，以比較三方影響子宮內(nèi)膜修復的機制。
　　方法：動物分組及取材同第二部分。分別采用免疫組化 SP法檢測VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白的表達，Western blot檢測 VEGF、Ang

15、-2蛋白的表達。
　　結果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜 VEGF蛋白的表達
　　1.1同一組不同時間點子宮內(nèi)膜VEGF蛋白的表達
　　各組VEGF蛋白表達呈先升高后降低的趨勢，48h達高峰（P＜0.05）。
　　.2同一時間點不同組間子宮內(nèi)膜VEGF蛋白表達的比較
　　與對照組比較，各個時間點，各實驗組子宮內(nèi)膜 VEGF蛋白表達均升高；各實驗組比較，24

16、h，調(diào)肝組、補腎組、補腎調(diào)肝組是顯著降低（P＜0.05）。32h，調(diào)肝組最低（P＜0.05）。40h，補腎調(diào)肝組、調(diào)肝組、補腎組依次顯著降低（P＜0.05）。48h，補腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。72h，補腎組最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白的表達
　　2.1同一組不同時間點子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白的表達
　　對照組 Ang-2蛋白表達呈先升

17、高后降低的趨勢，48h達高峰（P＜0.05）。
　　2.2同一時間點不同組間Ang-2蛋白表達的比較
　　與對照組比較，各個時間點，各實驗組子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白表達均升高；各實驗組比較，24h，調(diào)肝組最高（P＜0.05）。32h，補腎組、補腎調(diào)肝組、調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。40h，補腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。48h、72h，補腎組、調(diào)肝組、補腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。
　　3各組小鼠在孕酮

18、撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜 VEGFR2蛋白的表達
　　3.1同一組不同時間點子宮內(nèi)膜VEGFR2蛋白的表達
　　各組VEGFR2蛋白表達呈先升高后降低的趨勢，48h達高峰。（P＜0.05）。
　　3.2同一時間點不同組間VEGFR2蛋白表達的比較
　　與對照組比較，各個時間點，各實驗組子宮內(nèi)膜 VEGFR2蛋白表達均升高；各實驗組比較，24h，調(diào)肝組最高（P＜0.05），而32h，調(diào)肝

19、組最低（P＜0.05）。40h，補腎組最低（P＜0.05）。48h，補腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。72h，補腎組最高（P＜0.05）。
　　結論：補腎方、補腎調(diào)肝方均能通過上調(diào)子宮內(nèi)膜 VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達，加快子宮內(nèi)膜修復。其作用機制可能是二方通過上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜VEGF進一步影響CXCL2、Bcl-2、Ang-2、VEGFR2蛋白表達加快了子宮內(nèi)膜修復。補腎方對于子宮內(nèi)膜修復優(yōu)于補腎調(diào)肝方，其作用機制可