基于核酸適配體的幾種致病微生物新型檢測(cè)與防治方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的食源性疾病病源體?？刂粕抽T(mén)氏菌感染的有效措施之一，是將食品和臨床標(biāo)本中的致病菌快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)，以便及時(shí)采取應(yīng)對(duì)措施。由于沙門(mén)氏菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法的諸多局限性，研發(fā)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、成本低廉、快速高效的檢測(cè)新方法備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。另一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康的致病微生物是流感病毒，由它引起的流感是最嚴(yán)重的傳染病之一。流感的治療通常采用M2離子通道阻滯劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但流感病毒的快速變異催生了越來(lái)越多的耐藥毒株，

2、致使常規(guī)藥物的療效不斷降低。因此，揭示新的藥物作用機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型防治藥物是流感治療工作中亟待解決的問(wèn)題。鑒于此，我們?cè)噲D以核酸適配體為工具，針對(duì)幾種當(dāng)前給人類(lèi)健康帶來(lái)巨大威脅的病原微生物建立一個(gè)快速高效的檢測(cè)和防治平臺(tái)。圍繞這一主題，本研究以鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S.typhimurium）、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌(S.paratyphiA)鞭毛蛋白和H1N1流感病毒血凝素(H1N1-HA)為實(shí)驗(yàn)材料，開(kāi)展了以下幾方面的工作:
　　1、通過(guò)

3、Cell-SELEX篩選S.typhimurium核酸適配體。以S.typhimurium菌體作為Cell-SELEX的靶標(biāo)，篩選出6條DNA適配體，親和力和特異性鑒定結(jié)果顯示，它們的解離常數(shù)(Kd值)均小于100nM，其中StmApt6親和力最高，Kd僮為30±4nM，且在S.typhimurium以及一些其他的菌種如豬霍亂沙門(mén)氏菌(S.choleraesuis）、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌(E.

4、Coli) K88之間有著良好的區(qū)分度。
　　2、通過(guò)常規(guī)SELEX技術(shù)篩選S.paratyphi A鞭毛蛋白和H1N1流感病毒HA核酸適配體。以純化的S.paratyphi A鞭毛蛋白和純化的H1N1-HA為靶標(biāo)，采用常規(guī)SELEX技術(shù)，篩選出了4條S.paratyphi A鞭毛蛋白的DNA適配體和2條H1N1-HA的DNA適配體，親和力鑒定結(jié)果顯示，它們的Kd值均小于100 nM，其中分別以鞭毛蛋白適配體FlagApt3和HA

5、蛋白適配體HaApt1的親和力最高，其Kd值分別為27±27 nM和78±1nM。
　　3、采用核酸適配體和氧化石墨烯構(gòu)建S.typhimurium檢測(cè)系統(tǒng)。將上述StmApt6的5'端以FAM作修飾，再與氧化石墨烯非共價(jià)結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)基于碳納米材料的熒光適配體傳感器。該傳感器可以快速有效地對(duì)S.typhimurium進(jìn)行檢測(cè)，在理想的實(shí)驗(yàn)條件下，其靈敏度可達(dá)到100 CFU/mL，線(xiàn)性范圍為103～108 CFU/mL，以牛奶

6、為實(shí)際樣品對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行性能檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該系統(tǒng)對(duì)牛奶中的靶菌仍有著良好的反應(yīng)性，提示它對(duì)食品中S.typhimurium的定性和定量檢測(cè)有著一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　4、采用核酸適配體和單壁碳納米管構(gòu)建S.paratyphi A檢測(cè)系統(tǒng)。將上述FlagApt3去除部分固定序列后，在其5'端以FITC作修飾，3'端共價(jià)連接一段DNA酶序列，制成一個(gè)帶熒光素的分子探針，然后將其與碳納米管非共價(jià)結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)雙重信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)。樣品中S

7、.paratyphi A的量可以通過(guò)系統(tǒng)檢測(cè)到的熒光值或吸光度值來(lái)求出。利用該系統(tǒng)進(jìn)行牛奶樣品中S.paratyphi A的定量測(cè)定，可檢出105 CFU/mL（熒光法）和106 CFU/mL（分光光度法）的目標(biāo)菌。由于采用兩種信號(hào)分別對(duì)同一目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)，該方法大大地減少了假陽(yáng)性率產(chǎn)生的可能性，使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性得到顯著提升。
　　5、采用核酸適配體進(jìn)行抗流感病毒感染的研究。以上述HaApt1進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)和微量

8、中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，HaApt1能有效地抑制H1N1（A/Puerto Rico/8/1934）流感病毒所致的紅細(xì)胞凝集，直接阻止H1N1流感病毒在培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞上的吸附及對(duì)該細(xì)胞的感染，使病毒在細(xì)胞中的復(fù)制顯著減少。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判斷，HaApt1能與H1N1血凝素蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生緊密結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體之間的相互作用。因此，HaApt1對(duì)于開(kāi)展流感病毒HA-宿主細(xì)胞分子間相互作用的研究，以及抗流感病毒感染藥物的開(kāi)發(fā)具有