含銅不銹鋼冠脈支架材料對血管細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 冠心病是一種最常見的心血管疾病，是由于心臟冠狀動脈管壁形成粥樣斑塊所造成的血管腔狹窄和供血不足的心臟病變。目前，治療血管狹窄與閉塞等疾病的方法多采用經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（Percutaneous transluminal coronaryangioplasty PTCA），即在冠狀動脈內(nèi)球囊擴張術(shù)的基礎(chǔ)上在狹窄的部位植入支架，球囊擴張后，支架將病變部位血管擴張，增加了血流量以達(dá)到治療目的。然而，大約20％-3

2、0％接受過血管內(nèi)支架置入術(shù)治療的病人會發(fā)生血管再狹窄的現(xiàn)象。其中，約有10％的病人需要再次植入支架，這給患者帶來了巨大的經(jīng)濟以及心理上的負(fù)擔(dān)。為了減少二次血栓的形成，人們開展了新型心血管不銹鋼支架材料的基礎(chǔ)研究和醫(yī)用開發(fā)。銅是人體內(nèi)一種必需微量元素，參與了生命活動的多個環(huán)節(jié)，具有重要的生物學(xué)作用。因此，人們試圖將銅作為一種元素?fù)饺朐谛难懿讳P鋼支架材料中，防止血管再狹窄。但是，含銅不銹鋼能否作為血管支架的材料，還需要在分子和細(xì)胞水平上進

3、行全面和認(rèn)真的考證。本實驗利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究了含銅不銹鋼冠脈支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。該實驗的結(jié)果和結(jié)論對為探究再狹窄機制，新型金屬支架材料的研發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 實驗材料與方法:
　　 一、觀察細(xì)胞生長狀況
　　 將體外培養(yǎng)的大鼠平滑肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，然后取出長有

4、細(xì)胞的金屬片，用姬姆薩染液進行細(xì)胞染色，置于金相顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長狀況。
　　 二、細(xì)胞生長活性的測定
　　 取對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5和7天取樣，通過MTT法測定細(xì)胞的生長活性，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定OD值，求出每一組的平均OD值。
　　 三、細(xì)胞生長

5、曲線的測定
　　 取對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各組均在開始培養(yǎng)后的7天內(nèi)每天連續(xù)收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并通過臺盼藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進行細(xì)胞計數(shù)，并繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 四、細(xì)胞周期分析
　　 取對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組細(xì)胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血

6、清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，再更換為含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時間點分別取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中，通過流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞周期分析。
　　 五、細(xì)胞凋亡檢測
　　 取處于對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進行檢測。
　　 六、實時定量PCR檢測

7、>　　 取處于對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管中。然后提取RNA，測定各組RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，按照Takara說明書的要求進行Real-Time PCR的檢測。以基因GAPDH作為內(nèi)參，定量分析316L和316L-Cu兩種不銹鋼金屬支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。
　　

8、結(jié)果:
　　 1、通過顯微鏡對大鼠平滑肌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的觀察、MTT實驗對血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖活性的檢測和流式細(xì)胞儀對血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測可以看出，在316L-Cu不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞其細(xì)胞生長水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2、通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的檢測，可以看出培養(yǎng)在316L-Cu不銹鋼金屬材料上的血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在316